Transformaatio (genetiikka)

Kokeneet kirjoittajat eivät ole vielä tarkistaneet sivun nykyistä versiota, ja se voi poiketa merkittävästi 24. huhtikuuta 2021 tarkistetusta versiosta . vahvistus vaatii 1 muokkauksen .

Transformaatio ( eng.  transformation ) on prosessi, jossa bakteerisolu absorboi DNA - molekyylin ulkoisesta ympäristöstä. Transformaatiokykyäkseen solun täytyy olla pätevä , eli DNA-molekyylien on kyettävä tunkeutumaan siihen solukalvojen kautta. Transformaatiota käytetään aktiivisesti molekyylibiologiassa ja geenitekniikassa .

On huomattava, että termi "transformaatio" viittaa vain bakteerisoluihin. Vieraan DNA:n pääsyä eukaryoottisoluihin kutsutaan transfektioksi [1] .

Opiskeluhistoria

Muutosilmiön havaitsi ensimmäisen kerran vuonna 1928 Frederick Griffith , joka työskenteli pneumokokkien ( Streptococcus pneumoniae ) kanssa. Hän havaitsi, että avirulentit kannat , joista puuttuu kapseli, voivat saada jotain jopa kuolleista virulenteista soluista, joissa on kapseli, ja niistä tulee virulentteja. 16 vuoden kuluttua Avery, McLeod ja McCarthy osoittivat, että tämä sama aine oli DNA:ta, joka sisälsi kapselin muodostumiseen tarvittavat geenit [2] . He eristivät DNA:ta virulentista S. pneumoniae -kannasta ja osoittivat, että tämän DNA:n lisääminen yksinään avirulentin kannan soluihin muuttaa ne patogeeneiksi. Averyn ja kollegoiden tuloksiin suhtauduttiin aluksi skeptisesti, ja lopulta ne tunnustettiin luotettaviksi sen jälkeen, kun Joshua Lederberg kuvasi geneettisen siirron ilmiön - konjugaatio (vuonna 1947) ja transduktio (vuonna 1953) [3] .

Vuonna 1970 kokeellisesti osoitettiin, että Escherichia coli -solut voivat ottaa vastaan ​​bakteriofagin λ - DNA:ta ilman auttajafaagia sen jälkeen , kun niitä oli käsitelty kalsiumkloridiliuoksella [ 4] . Kaksi vuotta myöhemmin osoitettiin mahdollisuus siepata soluja samanlaisissa olosuhteissa plasmidi - DNA :ta [5] . Näin kemiallinen muunnos keksittiin. 1980-luvun lopulla bakteerisolujen muuntamiseen alettiin käyttää elektroporaatiota , joka monissa tapauksissa osoittautui tehokkaammaksi kuin kemiallinen transformaatio ja soveltui useampaan määrään kantoja [6] .

Mekanismi

Monet bakteerit pystyvät muuntumaan, esimerkiksi Streptococcus , Haemophilus , Bacillus , aktinomykeetit , syanobakteerit ja muut bakteerit. Siten gonorrhean aiheuttajassa Neisseria gonorrhoeaessa havaittu antigeeninen variaatio saadaan aikaan transformaatiolla, jossa solut siirtävät eri pilivarianttien geenejä toisilleen , minkä ansiosta ne kiinnittyvät isäntäorganismin soluihin [7] . Normaalitilassa suurten DNA-molekyylien tunkeutuminen bakteerisoluihin estetään tiheillä kansilla, joten transformoitumiskykyinen solu joutuu ns. kompetenssitilaan. Luonnollisissa olosuhteissa pätevyys hankkii osan viljelystä kasvun logaritmisessa vaiheessa tiettyjen kaksikomponenttisen järjestelmän kautta toimivien proteiinien (kompetenssitekijöiden) vaikutuksesta . Kloramfenikoli , joka estää proteiinisynteesiä , estää pätevien solujen muodostumisen [8] . On myös mahdollista, että bakteeriviljelmän tiheys vaikuttaa osaamisen kehittymiseen, koska se lisää osaamistekijöiden keskittymistä. Streptococcus mutansissa ja muissa Streptococcus -suvun lajeissa transformaatiota tapahtuu usein biofilmin muodostumisen aikana [9] . Bacillus subtiliksessa useat osaamisen kehittymiseen osallistuvat geenit osallistuvat myös itiöimiseen . Osaamisen kehittyminen log-vaiheessa johtuu ravinteiden puutteesta ja huomattavan määrän osaamistekijöiden kertymisestä [7] . Bakteriofagit voivat provosoida transformaation, mikä aiheuttaa DNA:n vapautumista kuolevista soluista [10] sekä bakteeri-DNA:n vaurioitumista [11] . Osaamisen hankkiminen on erittäin monimutkainen fysiologinen prosessi, joka Bacillus subtiliksessa vaatii noin 40 geenin ilmentymistä [ 12] .

Ensinnäkin toimivaltaiset solut sitovat DNA:ta pintaansa käyttämällä erityisiä reseptoreita , ja solu transformoituu paljon helpommin lineaarisilla fragmenteilla kuin pyöreillä. Nukleaasit pilkkovat DNA : n fragmenteiksi, jotka painavat jopa 4-5 miljoonaa Da , ja vain toinen kahdesta fragmenttiketjusta tulee soluun. Jotkut bakteerit, kuten pneumokokit ja Bacillus subtilis , voivat ottaa DNA:ta useista eri lähteistä, kun taas toiset, kuten Haemophilus , voivat ottaa DNA:ta vain oman lajinsa soluista . Fragmentit, joiden massa on alle 500 kDa, eivät pääse soluun [8] [2] .

Soluun saapumisen jälkeen yksijuosteinen fragmentti integroituu vastaanottajasolun genomiseen DNA:han. Transformaatio kestää 10-30 minuuttia ja eri bakteereissa tapahtuu noin 1 %:n taajuudella [13] .

Merkitys

Luonnollisissa olosuhteissa transformaatio antaa bakteerille mahdollisuuden saada ulkopuolelta geenejä, jotka voivat auttaa niitä sopeutumaan tiettyihin olosuhteisiin. Siten transformaatio on yksi horisontaalisen geeninsiirron mekanismeista konjugoinnin (solujen geneettisen materiaalin vaihto fyysisen kosketuksen aikana) ja transduktion kanssa, jossa faagi siirtää DNA-fragmentin [14] . Koska pätevyys voi johtua DNA-vauriosta ja se tapahtuu usein DNA:ta vaurioittavien aineiden vaikutuksesta (esimerkiksi Helicobacter pylorissa antibiootti siprofloksasiini indusoi transformaatiota , mikä stimuloi kaksijuosteisten katkeamien muodostumista [15] ), transformaatio voi toimia adaptiivisena mekanismina, joka edistää DNA:n korjausta . Vastaanottamalla DNA-fragmentin ulkopuolelta (etenkin saman lajin bakteerista), bakteeri voi käyttää sitä templaattina vaurioiden korjaamiseen homologisen rekombinaation kautta [16] .

Transformaatiosta on tullut rutiini molekyylibiologian tekniikka suurten määrien vaadittua plasmidia tuottamiseksi . Solujen saattamiseksi pätevyystilaan keinotekoisesti on kaksi päätapaa: elektroporaatio , jossa solut absorboivat DNA:ta lyhytaikaisen jännitteen jälkeen, ja kemiallinen transformaatio, jossa solut altistetaan erilaisille kaksiarvoisille ionisuoloille , kuten kalsiumkloridille . [2] [17] .

Muistiinpanot

  1. ↑ Transfektio . Protokollat ​​ja sovellukset -opas . Promega.
  2. ↑ 1 2 3 Dale & Park, 2004 , s. 167.
  3. ↑ Lederberg J. Genetiikan transformaatio DNA:n avulla: Averyn, MacLeodin ja McCartyn (1944) vuosipäiväjuhla.  (englanniksi)  // Genetiikka. - 1994. - Helmikuu ( osa 136 , nro 2 ) . - s. 423-426 . — PMID 8150273 .
  4. ↑ Mandel M. , Higa A. Kalsiumriippuvainen bakteriofagin DNA-infektio.  (Englanti)  // Journal Of Molecular Biology. - 1970. - 14. lokakuuta ( nide 53 , nro 1 ). - s. 159-162 . — PMID 4922220 .
  5. ↑ Cohen SN , Chang AC , Hsu L. Ei-kromosomaalinen antibioottiresistenssi bakteereissa: Escherichia colin geneettinen transformaatio R-tekijän DNA:lla.  (englanniksi)  // Amerikan yhdysvaltojen kansallisen tiedeakatemian julkaisut. - 1972. - elokuu ( osa 69 , nro 8 ). - P. 2110-2114 . — PMID 4559594 .
  6. ↑ Wirth R. , Friesenegger A. , ​​Fiedler S. 11 eri sukuun kuuluvien gramnegatiivisten bakteerien eri lajien transformaatio elektroporaatiolla.  (englanniksi)  // Molecular & General Genetics: MGG. - 1989. - maaliskuu ( osa 216 , nro 1 ) . - s. 175-177 . — PMID 2659971 .
  7. ↑ 12 Dale & Park, 2004 , s. 166.
  8. ↑ 1 2 Inge-Vechtomov, 2010 , s. 250.
  9. ↑ Aspiras MB , Ellen RP , Cvitkovitch DG ComX biofilmeissä kasvavien Streptococcus mutansin aktiivisuus.  (englanniksi)  // FEMS Microbiology Letters. - 2004. - 1. syyskuuta ( nide 238 , nro 1 ). - s. 167-174 . - doi : 10.1016/j.femsle.2004.07.032 . — PMID 15336418 .
  10. ↑ Keen EC , Bliskovsky VV , Malagon F. , Baker JD , Prince JS , Klaus JS , Adhya SL Novel "Superspreader" Bakteriofagit edistävät horisontaalista geeninsiirtoa transformaatiolla.  (englanniksi)  // MBio. - 2017. - 17. tammikuuta ( nide 8 , nro 1 ). - doi : 10.1128/mBio.02115-16 . — PMID 28096488 .
  11. ↑ Claverys JP , Prudhomme M. , Martin B. Kompetenssiregulonien induktio yleisenä vasteena stressiin grampositiivisissa bakteereissa.  (englanti)  // Annual Review Of Microbiology. - 2006. - Voi. 60 . - s. 451-475 . - doi : 10.1146/annurev.micro.60.080805.142139 . — PMID 16771651 .
  12. ↑ Solomon JM , Grossman AD Kuka on pätevä ja milloin: bakteerien luonnollisen geneettisen osaamisen säätely.  (englanniksi)  // Trends In Genetics : TIG. - 1996. - huhtikuu ( osa 12 , nro 4 ) . - s. 150-155 . — PMID 8901420 .
  13. ↑ Inge-Vechtomov, 2010 , s. 250-251.
  14. ↑ Johnston C. , Martin B. , Fichant G. , Polard P. , Claverys JP Bakteerimuunnos: jakautuminen, yhteiset mekanismit ja erilainen ohjaus.  (englanniksi)  // Luontoarvostelut. mikrobiologia. - 2014. - maaliskuu ( osa 12 , nro 3 ). - s. 181-196 . - doi : 10.1038/nrmicro3199 . — PMID 24509783 .
  15. ↑ Dorer MS , Fero J. , Salama NR DNA-vaurio laukaisee geneettisen vaihdon Helicobacter pylorissa.  (englanniksi)  // PLoS-patogeenit. - 2010. - 29. heinäkuuta ( nide 6 , nro 7 ). - P. e1001026-1001026 . - doi : 10.1371/journal.ppat.1001026 . — PMID 20686662 .
  16. ↑ Bernstein H., Bernstein C., Michod RE Luku 1: DNA:n korjaus sukupuolen ensisijaisena adaptiivisena tehtävänä bakteereissa ja eukaryooteissa // DNA Repair: New Research  (neopr.) / Kimura S., Shimizu S.. - Nova Sci . Publ., Hauppauge, NY, 2012. s. 1-49. — ISBN 978-1-62100-808-8 . Arkistoitu kopio (linkki ei saatavilla) . Haettu 16. marraskuuta 2018. Arkistoitu alkuperäisestä 29. lokakuuta 2013. 
  17. ↑ Donahue RA, Bloom FR Suuren volyymin muunnos korkean suorituskyvyn teholla kemiallisesti toimivaltaiset solut  //  Focus : Journal. - 1998. - heinäkuu ( osa 20 , nro 2 ) . - s. 54-56 .

Kirjallisuus

  Siirry Wikidata-kohteeseen  Sanakirjat ja tietosanakirjat