Trikarboksyylihappokierto (lyhennetty CTK , Krebsin sykli , sitraattikierto , sitruunahappokierto [1] [2] ) on keskeinen osa yleistä katabolian reittiä , syklistä biokemiallista prosessia, jonka aikana asetyyli jäämiä (CH 3 ) CO-) hapettuu hiilidioksidiksi ( CO 2 ). Tässä tapauksessa 2 CO 2 -molekyyliä , 3 NADH , 1 FAD H2 ja 1 GTP ( tai ATP ) muodostuu yhdessä syklissä [3] . NADH:ssa ja FADH 2 :ssa sijaitsevat elektronit siirtyvät tämän jälkeen hengitysketjuun [2] , jossa ATP:tä muodostuu oksidatiivisten fosforylaatioreaktioiden aikana .
Trikarboksyylihapposykli on avainvaihe kaikkien happea käyttävien solujen hengityksessä, monien kehon aineenvaihduntareittien leikkauspiste , välivaihe glykolyysin ja elektronien kuljetusketjun välillä . Merkittävän energiaroolin lisäksi syklillä on myös merkittävä plastinen tehtävä, eli se on tärkeä esiastemolekyylien lähde, josta muiden biokemiallisten muutosten aikana solujen elämälle tärkeitä yhdisteitä kuten aminohappoja , hiilihydraatteja , rasvahappoja jne. syntetisoidaan [4]
Sitruunahapon konversiosyklin elävissä soluissa (eli trikarboksyylihapposyklin) löysi ja tutki saksalainen biokemisti Hans Krebs , ja tästä työstä hänelle (yhdessä F. Lipmanin kanssa ) myönnettiin Nobel-palkinto (1953) [1] .
Eukaryooteissa kaikki Krebsin syklin reaktiot tapahtuvat mitokondrioiden sisällä , ja useimmissa bakteereissa syklin reaktiot tapahtuvat sytosolissa [5] .
Trikarboksyylihappokierron alussa asetyylikoentsyymi A ( asetyyli -CoA) luovuttaa asetyyliryhmänsä neljän hiilen yhdisteeksi - oksaloasetaatiksi (oksaloetikkahappo), ja muodostuu kuusihiilisitraattia (sitruunahappo). Asetyyli-CoA on yhdisteiden, kuten glukoosin , aminohappojen ja rasvahappojen, hapettumistuote [6] . Sitraatti isomeroidaan sitten isositraatiksi (isositrihapoksi), joka dehydrataan edelleen ja dekarboksyloidaan viiden hiilihapoksi , a -ketoglutaraatiksi . α-ketoglutaraatti dekarboksyloidaan jälleen ja muuttuu nelihiilisukkinaatiksi (meripihkahapoksi). Sukkinaatti muunnetaan sitten entsymaattisesti kolmessa vaiheessa neljän hiilen oksaloasetaatiksi, joka on valmis reagoimaan uuden asetyyli-CoA-molekyylin kanssa. Jokaisessa syklin käänteessä yksi asetyyliryhmä (eli kaksi hiiliatomia ) tulee kiertoon asetyyli-CoA:n muodossa ja kaksi hiiliatomia poistuu syklistä kahden CO 2 -molekyylin muodossa ; yhtä oksaloasetaattimolekyyliä käytetään sitraatin muodostamiseen, ja yksi sen jälkeen regeneroidaan. Oksaloasetaatti ei poistu kierrosta, ja yksi oksaloasetaattimolekyyli voi teoreettisesti sitoa rajattoman määrän asetyyliryhmiä ja itse asiassa oksaloasetaattia on soluissa hyvin pieninä pitoisuuksina. Neljä syklin kahdeksasta vaiheesta ovat oksidatiivisia prosesseja, joiden aikana vapautuva hapetusenergia varastoituu tehokkaasti pelkistetyiksi koentsyymeiksi NADH ja FADH 2 [5] .
Vaikka trikarboksyylihapposykli on keskeinen energia - aineenvaihdunnassa, sen rooli ei rajoitu energian hankkimiseen ja varastointiin. Neljän ja viiden hiilen rengasvälituotteet toimivat esiasteina monien yhdisteiden synteesissä . Näiden syklistä lähteneiden väliyhdisteiden täydentämiseksi solussa tapahtuu erityisiä anapleroottisia reaktioita [5] .
Kuten edellä mainittiin, kaikki trikarboksyylihapposyklin reaktiot tapahtuvat mitokondrioissa ja hengitysketju sijaitsee mitokondrioissa ( sisäkalvolla ). Useimmissa bakteereissa trikarboksyylihapposyklin entsyymit sijaitsevat sytosolissa, ja plasmakalvo suorittaa samanlaisia toimintoja kuin mitokondrioiden sisäkalvo [5] .
Trikarboksyylihapposykli sisältää 8 päävaihetta, joita käsitellään yksityiskohtaisesti alla.
Syklin ensimmäinen reaktio on asetyyli-CoA : n palautumaton kondensaatio oksaloasetaatin kanssa sitraattiksi , jota katalysoi sitraattisyntaasi (yleisen kaavion reaktio 1):
Tässä reaktiossa asetyyli-CoA:n asetyyliryhmän metyyliryhmä lisätään oksaloasetaatin karbonyyliryhmään (toinen hiiliatomi, C2-atomi) . Tämän reaktion aikana entsyymin aktiiviseen keskukseen muodostuu välituote - citroyyli-CoA . Se hydrolysoituu nopeasti ja pilkkoutuu vapaaksi CoA :ksi ja sitraatiksi, jotka poistetaan entsyymin aktiivisesta kohdasta . Tämän korkean energian tioeetterivälituotteen hydrolyysi tekee tästä reaktiosta erittäin eksergonisen . Suuri negatiivinen muutos sitraattisyntaasireaktion standardivapaassa energiassa on välttämätön syklin hallinnassa, koska, kuten aiemmin todettiin, normaali oksaloasetaatin pitoisuus solussa on hyvin alhainen. Tämän reaktion aikana vapautuva CoA osallistuu edelleen seuraavan pyruvaattimolekyylin oksidatiiviseen dekarboksylaatioon pyruvaattidehydrogenaasikompleksin vaikutuksesta [ 7] .
Sitraattisyntaasi kiteytettiin ja röntgendiffraktio analysoitiin sen substraatin ja estäjien läsnäollessa ja poissa ollessa . Tämän homodimeerisen entsyymin jokainen alayksikkö on yksittäinen polypeptidi , jossa on kaksi domeenia , joista toinen on suuri ja jäykkä ja toinen pienempi ja plastisempi; näiden domeenien välissä on entsyymin aktiivinen kohta. Oksaloasetaatti, ensimmäinen sitraattisyntaasia sitovista substraateista, indusoi merkittäviä konformaatiomuutoksia plastiseen domeeniin luoden sitoutumiskohdan toiselle substraattimolekyylille, asetyyli-CoA:lle (katso oikealla). Kun sitroyyli-CoA muodostuu entsyymin aktiiviseen kohtaan, entsyymissä tapahtuu toinen konformaatiomuutos johtuen tioesterin hydrolyysistä CoA:n vapauttamiseksi. Nämä konformaatiomuutokset, jotka aiheutuvat ensin sitoutumisesta substraattiin ja sitten välituotteeseen, estävät asetyyli-CoA:ssa olevan tioeetterisidoksen ennenaikaisen ja tuottamattoman katkeamisen. Sitraattisyntaasin kineettiset tutkimukset vahvistavat sen yllä kuvatun kahden substraatin mekanismin. Yllä oleva sitraattisyntaasireaktio on aldolikondensaatio [8] [9] (jotkin kirjoittajat kuitenkin pitävät sitä Claisen-kondensaationa [7] ). Alla on sitraattisyntaasireaktion mekanismi:
Entsyymi akonitaasi (tarkemmin sanottuna akonitaattihydrataasi) katalysoi sitraatin palautuvaa isomeroitumista isositraatiksi muodostamalla välituoteyhdistettä - trikarboksyylihappo- cis-akonitaattia , joka ei normaalisti poistu aktiivisesta keskustasta. Akonitaasi lisää vettä sen aktiiviseen keskukseen liittyvään cis -akonitaatin kaksoissidokseen kahdella eri tavalla: toisen seurauksena muodostuu sitraattia, toisen seurauksena isositraattia (yleensä reaktiot 2 ja 3 järjestelmä) [7] :
Vaikka tasapainoseos pH: ssa 7,4 ja 25 ° C sisältää alle 10 % isositraattia, reaktio siirtyy solussa oikealle, koska isositraatti imeytyy nopeasti syklin seuraavaan vaiheeseen ja sen pitoisuus pienenee. Aconitase sisältää rauta- rikkiklusterin , jonka tehtävänä on sekä sitoa substraatti aktiivisessa kohdassa että katalyyttisesti hydratoida tai dehydratoida. Soluissa, jotka eivät sisällä tarpeeksi rautaa , akonitaasi menettää rauta-rikkiklusterin ja saa säätelevän roolin raudan aineenvaihdunnassa (katso lisätietoja IRE:stä (biologia) ). Siten akonitaasi on yksi monista entsyymeistä, jolla on kaksi erillistä toimintoa [10] .
Alla on kaavio, joka havainnollistaa kuinka akonitaasin rauta-rikkiklusteri sitoo isositraattia ja muuntaa sen cis - akonitaatiksi:
Seuraavassa vaiheessa entsyymi isositraattidehydrogenaasi katalysoi isositraatin oksidatiivista dekarboksylaatiota muodostaen a-ketoglutaraattia (oksoglutaraattia). Entsyymin aktiivisessa kohdassa oleva Mn 2+ (tai Mg 2+ ) -ioni [11] on vuorovaikutuksessa välituotteen oksalosukkinaatin karbonyyliryhmän kanssa , joka muodostuu nopeasti, mutta ei poistu aktiivisesta kohdasta ennen kuin se dekarboksyloituu. ja muunnetaan α-ketoglutaraatiksi [10] .
Näitä muunnoksia käsitellään yksityiskohtaisesti alla (yleisen kaavion reaktiot 4 ja 5):
Isositraattidehydrogenaasin kahta eri muotoa (isotsyymiä) on löydetty soluista. Toisen toimintaan tarvitaan NAD + , toisen NADP + (lisäksi jälkimmäisen aktiivisuus vaatii Mg 2+ -ionin , ei Mn 2+ [11] ). Niiden suorittamat reaktiot ovat muuten identtisiä. Eukaryooteissa NAD-riippuvainen isotsyymi sijoittuu mitokondriomatriisiin ja on mukana trikarboksyylihapposyklissä. NADP-riippuvaisen isotsyymin, jota esiintyy sekä mitokondriomatriisissa että sytosolissa, päätehtävä voi olla NADPH :n muodostuminen , joka on välttämätön korjaaville anabolisille prosesseille [13] .
Trikarboksyylihapposyklin seuraavassa vaiheessa tapahtuu myös oksidatiivinen dekarboksylaatio, jossa α-ketoglutaraatti muuttuu sukkinyyli-CoA:ksi ja CO 2 : ksi a-ketoglutaraattidehydrogenaasikompleksin vaikutuksesta ; NAD + toimii elektronien vastaanottajana , kun taas CoA toimii sukkinyyliryhmän kantajana. α-ketoglutaraatin hapetusenergia varastoituu tioeetterisidoksen muodostumisen aikana sukkinyyli-CoA:ssa [13] (yleisen kaavion reaktio 6):
Tämä reaktio on lähes identtinen pyruvaatin oksidatiivisen dekarboksylaation pyruvaattidehydrogenaasireaktion kanssa, ja a-ketoglutaraattidehydrogenaasikompleksi on rakenteeltaan ja toiminnaltaan erittäin lähellä pyruvaattidehydrogenaasikompleksia (PDC). Se sisältää kolme entsyymiä , jotka ovat homologisia entsyymeille E 1 , E 2 ja E 3 MPC, ja sen kofaktorit ovat myös tiamiinipyrofosfaatti , lipoaatti , FAD, NAD ja koentsyymi A. Molemmilla komplekseilla on epäilemättä yhteinen evolutionaarinen esi-isä. Vaikka molempien kompleksien E1 - entsyymit ovat rakenteellisesti samanlaisia, niiden aminohapposekvenssit eroavat ja tietysti ne ovat spesifisiä eri substraateille: PDC -kompleksin E1 sitoo pyruvaattia ja a - ketoglutaraattidehydrogenaasikompleksin E1 . sitoo α-ketoglutaraattia. Molempien kompleksien E2 - entsyymit ovat myös hyvin samankaltaisia ja molemmat sitoutuvat kovalenttisesti lipoaattiin. Molempien kompleksien E3 - alayksiköt ovat identtisiä [14] .
Sukkinyyli-CoA, kuten asetyyli-CoA, sisältää tioeetterisidoksen, jolla on suuri negatiivinen standardi vapaa hydrolyysienergia (ΔG'® ≈ -36 kJ/mol). Trikarboksyylihapposyklin seuraavassa vaiheessa tioeetterisidoksen katkeamisen aikana vapautunutta energiaa käytetään muodostamaan fosfoanhydridisidos GTP:ssä tai ATP:ssä, kun taas sukkinyyli-CoA muunnetaan sukkinaatiksi [14] (reaktio 6 in yleinen kaava):
Tätä palautuvaa reaktiota katalysoi entsyymi sukkinyyli-CoA-syntetaasi (sukkinyylitiokinaasi); Tämän entsyymin molemmat nimet viittaavat siihen, että nukleosiditrifosfaatti osallistuu tähän reaktioon [14] .
Tämä energiaa varastoiva reaktio sisältää välivaiheita, joissa entsyymimolekyyli itse fosforyloituu aktiivisen kohdan histidiinitähteessä. Tämä fosforyyliryhmä, jolla on korkea siirtopotentiaali, siirtyy ADP:hen tai GDP:hen, jolloin muodostuu vastaavasti ATP tai GTP. Eläinsoluissa on kaksi sukkinyyli-CoA-syntetaasin isotsyymiä, joista toinen on spesifinen ADP:lle ja toinen GDP:lle. Sukkinyyli-CoA-syntetaasi koostuu kahdesta alayksiköstä: α-alayksikkö ( Mr = 32 000) sisältää fosforyloidun histidiinitähteen ( His246 ) ja CoA-sitoutumiskohdan, ja β-alayksikkö ( Mr = 42 000 to ADP) tarjoaa sitoutumisspesifisyyden. tai BKT. Aktiivinen paikka sijaitsee alayksiköiden välisessä tilassa. Sukkinyyli-CoA-syntetaasin kiderakenne sisältää kaksi "voimaheliksiä" ( englanniksi power helices ), yksi kussakin alayksikössä, ja nämä spiraalit on suunnattu siten, että niiden sähköiset dipolimomentit siirtävät osittain positiivisia varauksia negatiivisesti varautuneeksi histidiinifosfaatiksi ( P-His ); tämän ansiosta entsyymin fosforyloitu välimuoto stabiloituu [15] . Seuraava on sukkinyyli-CoA-syntetaasin katalysoima reaktiokaavio:
ATP:n (tai GTP:n) muodostuminen α-ketoglutaraatin oksidatiivisen dekarboksylaation aikana varastoidusta energiasta on substraattifosforylaatioreaktio , samoin kuin ATP:n synteesi glykolyysin aikana , jota katalysoivat glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi ja pyruvaatti . Sukkinyyli-CoA-syntetaasin syntetisoima GTP voi luovuttaa terminaalisen fosforyyliryhmänsä ADP:lle ATP:n muodostamiseksi reversiibelissä reaktiossa, jota katalysoi nukleosididifosfaattikinaasi :
GTP + ADP → GDP + ATP, ΔG′ o = 0 kJ/mol.Siten minkä tahansa sukkinyyli-CoA-syntetaasin isotsyymin toiminnan lopputulos on energian varastointi ATP:n muodossa. Gibbsin energian muutos nukleosididifosfaattikinaasireaktiossa on nolla, ja ATP ja GTP ovat energeettisesti ekvivalentteja toistensa kanssa [16] .
Sukkinyyli-CoA:sta muodostunut sukkinaatti hapettuu fumaraatiksi flavoproteiinisukkinaattidehydrogenaasin vaikutuksesta [17] (yleisen kaavion reaktio 8):
Eukaryooteilla sukkinaattidehydrogenaasi on tiukasti sitoutunut mitokondrion sisäkalvoon , bakteereissa se sijaitsee plasmakalvolla. Tämä entsyymi sisältää 3 erilaista rauta-rikkiklusteria ja yhden kovalenttisesti sitoutuneen FAD-molekyylin, joka on entsyymin proteettinen ryhmä . Sukkinaatista peräisin olevat elektronit kulkevat FAD- ja rauta-rikkiklusterien läpi, ja sitten ne elektronien kantajina kulkeutuvat hengityselectronien kuljetusketjuun, joka sijaitsee sisäisellä mitokondriokalvolla (bakteerien plasmakalvolla). FAD pelkistyy FADH 2 :ksi , mutta ubikinoni on toinen elektronien vastaanottaja [2] . Elektronien siirtyminen sukkinaatista näiden kantajien kautta lopulliseen elektronin vastaanottajaan, happeen , liittyy ATP:n synteesiin, ja elektroniparia kohti muodostuu 1,5 ATP-molekyyliä. Malonaatti , jota normaalisti puuttuu soluista, on vahva kilpaileva sukkinaattidehydrogenaasin estäjä, ja tämän yhdisteen lisääminen mitokondrioihin estää trikarboksyylihapposyklin toiminnan [17] .
Fumaraatin palautuvaa hydratoitumista L - malaatiksi katalysoi entsyymi fumaraasi (tarkemmin sanottuna fumaraattihydrataasi ). Tämän reaktion siirtymätuote on karbanioni [17] (yleisen kaavion reaktio 9):
Fumaraasireaktion mekanismi esitetään yksityiskohtaisemmin alla:
Fumaraasi on stereospesifinen entsyymi: se katalysoi kaksoissidoksen hydraatiota fumaraatissa ( trans - isomeeri ), mutta ei maleaatissa ( fumaraatin cis - isomeeri ). Fumaraasilla on myös stereospesifisyys käänteisreaktiossa: D-malaatti ei voi toimia sen substraattina [17] .
Trikarboksyylihapposyklin viimeisessä reaktiossa NAD-riippuvainen entsyymi L - malaattidehydrogenaasi katalysoi L-malaatin hapettumista oksaloasetaatiksi [17] (yleisen kaavion reaktio 10):
Normaalissa termodynaamisissa olosuhteissa tämän reaktion tasapaino on siirtynyt voimakkaasti vasemmalle, mutta elävässä solussa oksaloasetaatti on jatkuvasti mukana erittäin eksergonisessa sitraattisyntaasireaktiossa (vaihe 1). Tämä ylläpitää erittäin matalaa oksaloasetaattipitoisuutta solussa (< 10 -6 M), minkä vuoksi malaattidehydrogenaasireaktion tasapaino siirtyy oikealle [17] .
Vaikka trikarboksyylihapposyklin entsyymejä kuvataan yleensä mitokondriomatriisin liukoisiksi komponenteiksi (paitsi kalvoon sitoutunut sukkinaattidehydrogenaasi), on yhä enemmän todisteita siitä, että nämä entsyymit esiintyvät monientsyymikomplekseina mitokondrioissa . Syklientsyymit eristettiin onnistuneesti tuhoutuneiden solujen uutteista , mutta moniproteiinikompleksit, jotka muodostuivat proteiinin ei-kovalenttisista vuorovaikutuksista toisen kanssa tai solun rakennekomponentin ( kalvo , mikrotubulus , mikrofilamentti ) kanssa, tuhoutuivat. Soluuutetta valmistettaessa solujen sisältö, mukaan lukien entsyymit, laimennetaan kuitenkin 100- tai 1000-kertaisesti [18] .
Useat todisteet viittaavat siihen, että soluissa monientsyymikompleksit tarjoavat tehokkaan siirtymän yhden entsyymin reaktiotuotteista reitin seuraavaan entsyymiin. Tällaisia komplekseja kutsutaan metaboloneiksi . Useita trikarboksyylihapposyklin entsyymejä on eristetty osana supramolekulaarisia komplekseja tai niiden on havaittu liittyvän mitokondrioiden sisäkalvoon, tai niillä on osoitettu olevan hitaammat diffuusionopeudet kuin yksittäisillä proteiineilla liuoksessa. Tämä tarjoaa vahvaa näyttöä substraattien vaihdosta monientsyymikompleksien välillä ja muissa aineenvaihduntareiteissä, ja monet entsyymit, joiden uskotaan olevan "liukoisia", muodostavat itse asiassa hyvin organisoituja komplekseja, jotka vaihtavat välituotteita [18] .
Reaktiot, jotka muodostivat trikarboksyylihapposyklin yhden kierroksen, tarkasteltiin edellä. Kaksihiilinen asetyyliryhmä siirtyy kiertoon yhdistymällä oksaloasetaatin kanssa. Kaksi hiiliatomia poistuu syklistä kahden CO 2 -molekyylin muodossa, jotka muodostuvat isositraatin ja α-ketoglutaraatin hapettumisen aikana. Näiden hapetusreaktioiden aikana vapautuva energia varastoituu pelkistetyksi kolmeksi NADH-molekyyliksi, yhdeksi FADH2- molekyyliksi ja yhdeksi ATP- tai GTP-molekyyliksi. Jakson lopussa oksaaliasetaattimolekyyli regeneroidaan. On syytä huomata, että kaksi hiiliatomia, jotka lähtevät syklistä kahden CO2-molekyylin muodossa, eroavat kahdesta hiiliatomista, jotka tulivat kiertoon (tässä vuorossa) asetyyliryhmänä. Asetyyliryhmän tuomat hiiliatomit voivat poistua syklistä CO 2 :n muodossa vain syklin myöhemmissä käänteissä [3] .
Vaikka sitruunahapposykli tuottaa vain yhden ATP-molekyylin kierrosta kohti suoraan (kun sukkinyyli-CoA muuttuu sukkinaatiksi), syklin neljä oksidatiivista reaktiota antavat hengitysketjuun merkittävän määrän NADH:n ja FADH 2 :n toimittamia elektroneja , ja siten tarjoavat merkittävän määrän ATP:tä oksidatiivisen fosforylaation aikana [3] .
Glykolyysin aikana yksi glukoosimolekyyli tuottaa kaksi pyruvaattimolekyyliä, 2 ATP ja 2 NADH. Oksidatiivisen fosforylaation aikana kahden elektronin siirtymä NADH:sta O 2 :ksi tuottaa 2,5 ATP:tä ja kahden elektronin siirtymä FADH 2 :sta O 2 :ksi tuottaa 1,5 ATP:tä. Kun molemmat pyruvaattimolekyylit hapetetaan 6 CO 2 :ksi pyruvaattidehydrogenaasikompleksin vaikutuksesta ja trikarboksyylihapposyklin aikana ja elektronit siirtyvät 02 :ksi oksidatiivisen fosforylaation aikana, ATP:n kokonaissaanto on 32 molekyyliä glukoosimolekyyliä kohti [3] :
| Reaktio | ATP:n tai pelkistettyjen koentsyymien tuotanto | ATP:n kokonaisteho |
|---|---|---|
| glukoosi → glukoosi-6-fosfaatti | −1 ATP | −1 |
| fruktoosi 6-fosfaatti → fruktoosi 1,6-bisfosfaatti | −1 ATP | −1 |
| 2 glyseraldehydi-3-fosfaatti → 2 1,3-bisfosfoglyseraatti | 2 NADH | 3 tai 5 |
| 2 1,3-bisfosfoglyseraatti → 2 3-fosfoglyseraatti | 2 ATP | 2 |
| 2 fosfoenolipyruvaatti → 2 pyruvaatti | 2 ATP | 2 |
| 2 pyruvaatti → 2 asetyyli-CoA | 2 NADH | 5 |
| 2 isositraatti → 2 α-ketoglutaraatti | 2 NADH | 5 |
| 2 a-ketoglutaraatti → 2 sukkinyyli-CoA | 2 NADH | 5 |
| 2 sukkinyyli-CoA → 2 sukkinaattia | 2 ATP (tai 2 GTP) | 2 |
| 2 sukkinaattia → 2 fumaraattia | 2 FADH 2 | 3 |
| 2 malaattia → 2 oksaaliasetaattia | 2 NADH | 5 |
| Yhteensä : 30-32 |
32 ATP-molekyyliä vastaavat arvoa 32 × 30,5 kJ / mol = 976 kJ / mol, mikä on 34% glukoosin täydellisen hapettumisen teoreettisesta maksimista - 2 840 kJ / mol. Nämä laskelmat tehtiin ottamalla huomioon vapaan energian muutosten standardiarvot, mutta jos otamme huomioon solun todellisen ATP:n sisältämän vapaan energian tarpeen, niin hapetusprosessin tehokkuus lähestyy 65 % teoreettisesta. enintään [19] .
| Vaihe | yksi | 2 | 3 | neljä | 5 | 6 | 7 | kahdeksan |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ΔG'°, kJ/mol | -32.2 | 13.3 | -7.1 | -33.5 | -2.9 | 0 | -3.8 | 29.7 |
Aineenvaihduntareitin entsyymien säätely voidaan suorittaa allosteeristen efektorien ja kovalenttisten modifikaatioiden avulla pitämällä solun väli- ja lopputuotteiden pitoisuus vakiona ja estämällä niiden liiallinen muodostuminen. Hiiliatomien siirtyminen pyruvaatista trikarboksyylihappokiertoon on hienosäädelty kahdella tasolla: pyruvaatin muuttuminen asetyyli-CoA:ksi, syklin lähtöyhdiste (pyruvaattidehydrogenaasireaktio) ja aktiivisen asetaatin pääsy kiertoon ( sitraattisyntaasireaktio). Asetyyli-CoA ei muodostu ainoastaan pyruvaattidehydrogenaasikompleksista (PDH), vaan myös rasvahappojen hapettumisesta (β-hapetus) ja joistakin aminohapoista, joten näiden reittien hallinta on tärkeää myös pyruvaatin hapettumisen säätelylle ja trikarboksyylihapposykli. Lisäksi sykliä säätelevät isositraattidehydrogenaasi- ja α-ketoglutaraattidehydrogenaasireaktiot. Alla tarkastellaan itse trikarboksyylihappokierron säätelyä [20] ; Katso pyruvaatin oksidatiivisen dekarboksylaation säätely artikkelista Pyruvaatin oksidatiivinen dekarboksylaatio .
Siten metaboliittien pääsy trikarboksyylihappokiertoon on tiukasti säännelty. Metaboliittien saannin määrää kolme tekijää: substraatin saatavuus, kertyneiden tuotteiden tukahduttaminen ja syklin alkuvaiheita katalysoivien entsyymien allosteerinen takaisinkytkentävaimennus [21] .
Jokaisesta syklin kolmesta eksergonisesta vaiheesta – sitraattisyntaasin, isositraattidehydrogenaasin ja α-ketoglutaraattidehydrogenaasin katalysoimista vaiheista – voi tietyissä olosuhteissa tulla nopeutta rajoittava . Sitraattisyntaasin substraattien (asetyyli-CoA ja oksaloasetaatti) saatavuus vaihtelee solun tilasta riippuen ja joskus estää sitraatin muodostumisnopeutta. NADH, isositraatin ja α-ketoglutaraatin hapettumistuote, kerääntyy tietyissä olosuhteissa, ja korkealla [NADH]/[NAD + ]-suhteella molemmat dehydrogenaasireaktiot estyvät voimakkaasti. Samoin solussa malaattidehydrogenaasireaktio on tiukassa tasapainossa (eli substraatti rajoittaa sitä), ja suurella [NADH]/[NAD + ] -suhteen arvolla ja alhaisella oksaloasetaatin pitoisuudella syklin ensimmäinen vaihe hidastuu. Tuotteiden kerääntyminen rajoittaa kaikkia kolmea syklin rajoittavaa vaihetta: sukkinyyli-CoA estää a-ketoglutaraattidehydrogenaasia (sekä sitraattisyntaasia); sitraatti estää sitraattisyntaasin; lopputuote, ATP, estää sitraattisyntaasia ja isositraattidehydrogenaasia. ADP, sitraattisyntaasin allosteerinen aktivaattori, vähentää ATP:n estävää vaikutusta tähän entsyymiin. Selkärankaisten lihaskudoksessa olevat Ca 2+ -ionit , jotka toimivat signaalina supistumiselle ja jotka liittyvät ATP:n tarpeen lisääntymiseen, aktivoivat isositraattidehydrogenaasia ja α-ketoglutaraattidehydrogenaasia sekä pyruvaattidehydrogenaasikompleksia (PDH). Siten substraattien ja välituotteiden pitoisuus trikarboksyylihappokierrossa määrää sellaisen hiilivirran sen läpi, jossa muodostuvat ATP:n ja NADH:n pitoisuudet ovat optimaaliset [22] .
Normaalisti glykolyysin ja trikarboksyylihapposyklin nopeudet liittyvät läheisesti toisiinsa, joten vain sellainen määrä glukoosia muuttuu pyruvaaiksi, joka antaa syklille riittävän määrän "polttoainetta" - asetyyli-CoA:n asetyyliryhmiä. Pyruvaatin, laktaatin ja asetyyli-CoA:n pitoisuudet pysyvät normaalisti vakioina. Glykolyysin nopeus ei liity sitruunahapposyklin nopeuteen pelkästään glykolyysin eston vuoksi korkeilla ATP- ja NADH-tasoilla, mikä on ominaista sekä glykolyysille että glukoosin hapettumisen hengitysvaiheelle, vaan myös sitraattipitoisuuden kautta. Sitraatti, trikarboksyylihapposyklin ensimmäinen tuote , on glykolyyttisen entsyymin fosfofruktokinaasi-1 :n tärkeä allosteerinen estäjä [18] .
Kahdeksanvaiheinen syklinen prosessi yksinkertaisen asetyylikaksihiiliryhmän hapettamiseksi CO 2 : ksi saattaa tuntua tarpeettoman monimutkaiselta eikä täytä biologista maksimaalisen taloudellisuuden periaatetta . Trikarboksyylihapposyklin rooli ei kuitenkaan rajoitu asetaatti-ionin (ja siten hiilihydraattien, rasvahappojen ja joidenkin aminohappojen, joiden hapettumisen aikana se muodostuu) hapetukseen. Tämä reitti muodostaa välituotteiden aineenvaihdunnan ytimen. Monien katabolisten prosessien neljän ja viiden hiilen lopputuotteet tulevat kiertoon välivaiheissa. Esimerkiksi oksaloasetaatti ja α-ketoglutaraatti ovat asparagiini- ja glutamiinihappojen katabolian tuotteita , joita muodostuu proteiinien hajoamisen aikana. Monet syklin välituotteet osallistuvat joihinkin aineenvaihduntaprosesseihin ja toimivat esiasteina monissa anabolisissa prosesseissa. Siten trikarboksyylihapposykli on amfibolinen reitti; se yhdistää katabolisia ja anabolisia prosesseja [23] .
Pyruvaatti on hiilihydraattien hapettumisen tuote. Lisäksi pyruvaatti muuttuu asetyyli-CoA:ksi ja on mukana trikarboksyylihapposyklissä. Lisäksi asetyyli-CoA on myös rasvahappojen hapettumisen tuote, joten trikarboksyylihappokierto osallistuu myös rasvan kataboliaan [24] . On syytä huomata, että pyruvaatti voi olla mukana trikarboksyylihappokierrossa ilman, että se muuttuu asetyyli-CoA:ksi, vaan muuttuu malaatiksi omenaentsyymin vaikutuksesta [ 25] .
Trikarboksyylihappokierrossa muodostuvasta α-ketoglutaraatista syntetisoidaan aminohapot glutamiini , glutamaatti, proliini ja arginiini . Sukkinyyli-CoA toimii prekursorina porfyriinien ja hemin synteesissä . Sitraatti osallistuu rasvahappojen ja sterolien synteesiin (asetyyli-CoA muodostuu sitraatista, lisäksi se toimii säätelijänä [26] ). Malaatti voidaan kuljettaa mitokondrioista sytoplasmaan, jossa se muuttuu palautuvasti oksaloasetaatiksi. Tuloksena oleva oksaloasetaatti voi toimia esiasteena aminohappojen aspartaatin, asparagiinin , metioniinin , treoniinin ja isoleusiinin sekä pyrimidiinien synteesille . Se voidaan myös muuntaa fosfoenolipyruvaattiksi GTP:n kustannuksella, ja fosfoenolipyruvaatti (PEP) voi toimia esiasteena fenyylialaniinin , tyrosiinin , tryptofaanin , seriinin , glysiinin ja kysteiinin biosynteesissä . Pyruvaatti, jota tuotetaan PEP:stä glykolyysin aikana, voi tulla alaniinin , leusiinin ja valiinin esiaste , ja se voi myös olla mukana glukoneogeneesissä [24] [25] .
Trikarboksyylihapposyklin välituotteet, jotka ovat poistuneet syklistä ja osallistuvat erilaisten yhdisteiden synteesiin, korvataan erityisillä anapleroottisilla reaktioilla . Normaaleissa olosuhteissa reaktiot, joissa syklin välituotteet osallistuvat muihin aineenvaihduntareitteihin ja reaktiot, jotka korvaavat niiden poistumisen, ovat dynaamisessa tasapainossa, joten sitruunahapposyklin välituotteiden pitoisuus pysyy vakiona [25] .
Alla oleva taulukko näyttää tärkeimmät anapleroottiset reaktiot [25] :
| Reaktio | Entsyymi | kudos/organismi |
|---|---|---|
| pyruvaatti + HCO 3 − + ATP ⇌ oksaloasetaatti + ADP + F n | pyruvaattikarboksylaasi | maksa , munuaiset |
| fosfoenolipyruvaatti + CO 2 + BKT ⇌ oksaloasetaatti + GTP | fosfoenolipyruvaattikarboksikinaasi | sydän , luurankolihakset |
| fosfoenolipyruvaatti + HCO 3 − ⇌ oksaloasetaatti + F n | fosfoenolipyruvaattikarboksylaasi | korkeammat kasvit , hiivat , bakteerit |
| pyruvaatti + HCO 3 − + NAD(P)H ⇌ malaatti + NAD(P) + | malik-entsyymi | levinnyt laajalti eukaryoottien ja bakteerien keskuudessa |
Nisäkkään maksassa ja munuaisissa tärkein anapleroottinen reaktio on pyruvaatin palautuva karboksylaatio oksaloasetaatiksi, jota katalysoi pyruvaattikarboksylaasientsyymi . Kun oksaaliasetaatin tai muiden välituotteiden määrä vähenee sitraattisyklissä, pyruvaatti karboksyloituu, jolloin muodostuu lisää oksaloasetaattia. Karboksyyliryhmän entsymaattinen lisääminen pyruvaattiin vaatii energiaa, joka saadaan ATP:stä: karboksyyliryhmän lisäämiseen pyruvaattiin tarvittava vapaa energia on lähes yhtä suuri kuin ATP:stä saatava vapaa energia. Pyruvaattikarboksylaasi on säätelyentsyymi ja inaktivoituu asetyyli-CoA:n, positiivisen allosteerisen modulaattorin, puuttuessa. Kun asetyyli-CoA:ta, trikarboksyylihappokierron "polttoainetta", on läsnä ylimäärin, se stimuloi pyruvaattikarboksylaasireaktiota ja edistää siten oksaloasetaatin muodostumista, mikä puolestaan mahdollistaa asetyyli-CoA:n lisäämisen. trikarboksyylihapposykli. Pyruvaattikarboksylaasireaktion toteuttamiseen tarvitaan biotiinivitamiinia , joka toimii hiilidioksidia kuljettavan entsyymin proteettisena ryhmänä . Biotiinin on oltava läsnä ihmisen ruokavaliossa, sitä löytyy monista elintarvikkeista ja sitä syntetisoivat suolistobakteerit [27] .
Myös muita yllä olevassa taulukossa lueteltuja anapleroottisia reaktioita ohjataan niin, että saadaan aikaan riittävä välituotekonsentraatio trikarboksyylihapposyklin toimintaan. Esimerkiksi fosfoenolipyruvaattikarboksylaasi aktivoituu fruktoosi-1,6-bisfosfaatilla, glykolyysin välituotteella, joka kerääntyy ylimääräisen palorypälehapon olosuhteissa [27] .
Kasveissa ja bakteereissa asetyyli-CoA voi muuttua glyoksylaattisyklin aikana sukkinaatiksi. Siten nämä organismit voivat suorittaa neutraalien rasvojen anapleroottista hajoamista (lisätietoja glyoksylaattisyklistä, katso alla) [4] .
On muitakin anapleroottisia tapoja. Aminohapot histidiini, proliini, arginiini, glutamiini ja glutamaatti voidaan muuttaa α-ketoglutaraatiksi ja palauttaa sen pitoisuus; isoleusiini, valiini, metioniini, tryptofaani - sukkinyyli-CoA:ksi, aspartaatti, fenyylialaniini ja tyrosiini - fumaraatiksi; aspartaatti ja aspragiini oksaaliasetaatiksi. Aminohapot alaniini, seriini, treoniini, kysteiini ja glysiini voidaan muuttaa pyruvaaiksi, joka on välttämätön trikarboksyylihapposyklille [24] .
Kuten edellä mainittiin, joissakin anaerobisissa organismeissa on epätäydellinen trikarboksyylihapposykli . Heille se ei tarkoita energian saamista, vaan esiasteiden saamista biosynteettisiin prosesseihin. Nämä organismit käyttävät syklin kolmea ensimmäistä reaktiota tuottamaan α-ketoglutaraattia, mutta koska α-ketoglutaraattidehydrogenaasi puuttuu, ne eivät voi suorittaa kaikkia syklin muunnoksia. Niissä on kuitenkin neljä entsyymiä, jotka katalysoivat oksaloasetaatin peräkkäistä muuttumista sukkinyyli-CoA:ksi, joten ne voivat muodostaa oksaloasetaatista malaattia, fumaraattia, sukkinaattia ja sukkinyyli-CoA:ta reaktioissa, jotka ovat päinvastaisia kuin "normaalit" (hapettavat) reaktiot. sykli. Tämä reitti on fermentaatio , jonka aikana isositraatin hapettumisen aikana muodostunut NADH muuttuu NAD + :ksi pelkistämällä oksaloasetaatti sukkinaatiksi [23] .
Kasveissa , joissakin selkärangattomissa ja joissakin mikro -organismeissa (esim. hiiva, Escherichia coli ) asetyyli-CoA muuttuu sukkinaatiksi glyoksylaattisyklin kautta , joka liittyy läheisesti trikarboksyylihappokiertoon. Glyoksylaattisyklin yleinen yhtälö näyttää tältä:
2 asetyyli-CoA + NAD + + 2H 2 O → sukkinaatti + 2CoA + NADH + H +Tuloksena oleva sukkinaatti osallistuu edelleen biosynteettisiin prosesseihin. Kasveissa glyoksylaattisykli sijoittuu erityisiin organelleihin , glyoksisomeihin [28] [4] .
Jotkut bakteerit pystyvät suorittamaan trikarboksyylihappojen käänteisen kierron . Tämän prosessin aikana trikarboksyylihapposyklin reaktiot tapahtuvat vastakkaiseen suuntaan: missä hiiliatomit tulevat kiertoon asetyyli-CoA:n muodossa ja hapettuvat sen jälkeen CO 2 :ksi , käänteisessä kierrossa asetyyli päinvastoin. -CoA on julkaistu. Sen toteuttamiseen tarvitaan elektronien luovuttajia, ja näihin tarkoituksiin bakteerit käyttävät vetyä , sulfideja tai tiosulfaatteja . Muihin käänteisen syklin entsyymeihin kuin vastaaviin eteenpäin kulkeviin entsyymeihin kuuluvat ATP-sitraattilyaasi , 2-oksoglutaraatti: ferredoksinoksireduktaasi , pyruvaattisyntaasi . Trikarboksyylihappojen käänteistä kiertoa pidetään vaihtoehtona fotosynteesille hiilihydraattien muodostumisen kautta [29] .
Trikarboksyylihappokierto on yleinen asetyyliryhmien hapettumisreitti, johon käytännöllisesti katsoen kaikki elävien organismien aineenvaihduntareitit pelkistyvät. Se ei ole ollenkaan lyhin reitti asetaatin hapettumiselle CO 2 :ksi , mutta luonnonvalinnan on havaittu olevan suurimmat edut. Varhaiset anaerobit ovat saattaneet käyttää joitakin trikarboksyylihapposyklin reaktioita lineaarisissa biosynteettisissä prosesseissa. Itse asiassa jotkin nykyaikaiset anaerobiset mikro-organismit käyttävät epätäydellistä trikarboksyylihappojen kiertoa, eivät energialähteenä, vaan esiasteiden lähteenä biosynteettisissä prosesseissa (katso lisätietoja kohdasta Modifikaatiot ). Yhdessä vedestä O 2 :ta muodostavien sinilevien evoluution kanssa maapallon ilmakehä muuttui aerobiseksi, ja luonnollisen valinnan vaikutuksesta organismeissa kehittyi aerobinen aineenvaihdunta, paljon tehokkaampi kuin anaerobinen käyminen [23] .
Kun reittien, kuten trikarboksyylihapposyklin, säätelymekanismit häiriintyvät, seurauksena voi olla vakava sairaus. Syklientsyymejä koodaavat taloudenhoitogeenit , ja näiden geenien toiminnallisten kopioiden puuttuminen voidaan selittää syklin kudosspesifisten ominaisuuksien läsnäololla [30] . Ihmisillä kiertoentsyymigeeneihin vaikuttavat mutaatiot ovat hyvin harvinaisia, mutta ne, joita esiintyy, ovat haitallisia.
Fumaraasigeenin puutteet johtavat sileän lihaksen kasvaimiin ( leiomyoomiin ) ja munuaisiin ; sukkinaattidehydrogenaasin mutaatiot aiheuttavat lisämunuaisen syöpää ( feokromosytoomaa ). Soluviljelmät , joissa on tällaisia mutaatioita, keräävät fumaraattia ( fumaraasimutaatioiden tapauksessa) ja vähemmässä määrin sukkinaattia (sukkinaattidehydrogenaasimutaatioiden tapauksessa), ja tämä kerääntyminen aktivoi hypoksian aiheuttaman transkriptiotekijän HIF-1a . Syövän kehittyminen voi olla seurausta pseudohypoksiatilasta. Soluissa, joissa on näitä mutaatioita, HIF-1a:n normaalisti säätelemien geenien ilmentyminen lisääntyy. Fumaraasi- ja sukkinaattidehydrogenaasigeenien mutaatioiden tällaiset seuraukset mahdollistavat niiden luokittelun tuumorisuppressoriksi [31] .
Fumaraasivikojen ja hermoston häiriöiden välinen suhde on osoitettu [32] .
Mutaatiot, jotka muuttavat α-ketoglutaraattidehydrogenaasin aktiivisuutta, johtavat aminohappojen hajoamistuotteiden kertymiseen virtsaan, mikä saa virtsan haisemaan vaahterasiirapilta . Tätä sairautta kutsutaan leukinoosiksi ( eng. vaahterasiirappivirtsatauti ) [33] .
Albert Szent-Györgyi löysi vuonna 1930 useita trikarboksyylihapposyklin yhdisteitä ja reaktioita , erityisesti hän vahvisti fumaraatin roolin, joka on syklin avainkomponentti. Löydöksistään Szent-Györgyi sai fysiologian tai lääketieteen Nobel-palkinnon vuonna 1937 [34] . Täydellisen reaktioiden ja muodostuneiden yhdisteiden sarjan perusti vuonna 1937 Hans Adolf Krebs, josta hän sai Nobel-palkinnon vuonna 1953 (yhdessä F. Lipmanin kanssa) [35] (hänen kunniaksi trikarboksyylihappokierto sai yhden sen nimistä) . Vuonna 1948 E. Kennedy ja Albert Lehninger totesivat , että eukaryooteissa kaikki syklin reaktiot tapahtuvat mitokondrioissa [5] .
Kun raskas hiiliisotooppi 13 C ja radioaktiiviset isotoopit 11 C ja 14 C tulivat saataville noin 60 vuotta sitten , niitä käytettiin jäljittämään hiiliatomien polkua trikarboksyylihappokierrossa. Yksi näistä kokeista antoi hyvin odottamattomia tuloksia. Hydroksyylileimattu asetaatti yhdistettiin leimaamattoman oksaloasetaatin kanssa leimatun sitraatin muodostamiseksi. Koska sitraatti on symmetrinen molekyyli, oletettiin, että se muuttuisi α-ketoglutaraatiksi, jonka joukossa olisi molekyylejä, jotka on merkitty eri hiiliatomeihin. Kuitenkin vain yksi "laji" α-ketoglutaraattimolekyylejä oli eristetty soluista, ja tutkijat päättelivät, että sitraatti ja mikään muu symmetrinen molekyyli ei voinut olla välituote polulla asetaatista α-ketoglutaraattiin; he ehdottivat, että asetaatin ja oksaloasetaatin kondensaatio tuotti epäsymmetrisen trikarboksyylihapon, kuten cis -akonitaattia tai isositraattia . Vuonna 1948 Alexander Ogston perusti sitraatin prokiraalisuuden (taipumus epäsymmetrisiin reaktioihin kiraalisen keskuksen puuttuessa ), mikä selittää kokeiden tulokset ja vahvisti, että syklin ensimmäisessä vaiheessa muodostuu sitraattia [36] .
Krebsin sykliin osallistuvien happojen muistamisen helpottamiseksi on olemassa muistisääntö :
Kokonainen ananas ja viipale souffléa Today Actually My Lunch , joka vastaa sarjaa - sitraatti, cis -akonitaatti, isositraatti, alfa-ketoglutaraatti, sukkinyyli-CoA, sukkinaatti, fumaraatti, malaatti, oksaloasetaatti.
Siellä on myös seuraava muistoruno (sen kirjoittaja on KSMU :n biokemian osaston assistentti E. V. Parshkova [37] ):
Hauki ja asetyyli- sitruunaliete , Mutta narsissi hevosen kanssa pelkäsi Hän on isolimon ylitsensä, mutta Alfa-ketoglutaari als. Succinyl Xia -koentsyymi , Amber ils fumar ovo, Apple ek säästetty talveksi, Kääntyi hauki oh taas.(oksaloetikkahappo, sitruunahappo, cis -akoniittihappo, isositrihappo, α-ketoglutaarihappo, sukkinyyli-KoA, meripihkahappo, fumaarihappo, omenahappo, oksaloetikkahappo).
Toinen versio runosta:
Hauki söi asetaatin, siitä tulee sitraattia cis -akonitaatin kautta tuleeko se isositraattia antaa vedyt YLI, se menettää CO2:ta erittäin iloinen siitä alfa-ketoglutaraatti hapetus tulossa: NAD varastaa vetyä B1 ja lipoaatti koentsyymi A:lla kiireessä, ota CO 2 ja energiaa on vähän ilmestyi sukkinyylissä heti gtf syntyi ja sukkinaatti jäi. joten hän pääsi FAD:iin, joka tarvitsee vetyä menetetyt vedyt, hänestä tuli vain fumaraatti. fumaraatti joi vettä, ja se muuttui malaattiksi tässä tulin malate NAD:iin, ostettuja vetyä Hauki ilmestyi uudelleen ja piiloutui hiljaa Asetaatin vartiointi...