Ochoa, Pohjois

Severo Ochoa
Espanja  Severo Ochoa de Albornoz
Syntymäaika 24. syyskuuta 1905( 1905-09-24 ) [1] [2] [3] […]
Syntymäpaikka Luarca , Espanja
Kuolinpäivämäärä 1. marraskuuta 1993( 11.1.1993 ) [1] [2] [3] […] (88-vuotias)
Kuoleman paikka Madrid , Espanja
Maa  Espanja USA 
Tieteellinen ala biokemia
Työpaikka
Alma mater
Akateeminen tutkinto PhD ( 1930 )
tieteellinen neuvonantaja Otto Meyerhof
Henry Dale
Opiskelijat Manuel Losada Villasante [d]
Palkinnot ja palkinnot Nobel palkinto Nobelin fysiologian tai lääketieteen palkinto ( 1959 )
Premio Lección Conmemorativa Jiménez Díaz ( 1969 )
Yhdysvaltain kansallinen tiedemitali ( 1979 )
 Mediatiedostot Wikimedia Commonsissa

Severo Ochoa de Albornoz ( espanjalainen  Severo Ochoa de Albornoz ; 24. syyskuuta 1905 , Luarca , Espanja  - 1. marraskuuta 1993 , Madrid ) - espanjalainen ja amerikkalainen biokemisti, fysiologian tai lääketieteen Nobel-palkinnon voittaja vuonna 1959 " RNA:n ja DNA:n biosynteesin mekanismit" [5] (yhdessä A. Kornbergin kanssa ).

Elämäkerta ja tieteellinen työ

koulutus. Ensimmäiset teokset

Severo Ochoa syntyi 25. syyskuuta 1905 Luarcassa, pienessä kaupungissa Asturiassa Atlantin valtameren rannikolla [6] . Hän oli nuorin seitsemästä pojasta, hänen isänsä oli lakimies ja liikemies ja kuoli Severon ollessa 7-vuotias.

Isänsä kuoleman jälkeen perhe, joka halusi asua Välimeren ilmastossa, muutti Malagaan rannikolle ja asui siellä syyskuun puolivälistä kesäkuun puoliväliin. Siellä Severo meni jesuiitojen tukemaan yksityiseen kouluun ja sitten lukioon, josta hän suoritti kandidaatin tutkinnon vuonna 1921. Viimeisenä lukiovuotena hän kiinnostui luonnontieteistä ja astui vuonna 1923 Madridin yliopiston lääketieteelliseen tiedekuntaan. Hän ei koskaan halunnut lääkäriksi, mutta lääketiede antoi hänelle mahdollisuuden opiskella biologiaa. Hän kiehtoi espanjalaista neurotieteilijää Santiago Ramón y Cajalia ja haaveili histologian opiskelusta hänen johdolla. Mutta Severon suureksi valitukseksi jo yli 70-vuotias Cajal siirtyi lääketieteelliseen kouluun siirtyessään pois tieteestä. Severo Ochoa ei kuitenkaan koskaan kyllästynyt lukemaan Cajalin elämäkertaa uudelleen, ja hänen kirjallaan Neuvoja tieteelliseen tutkimukseen oli valtava vaikutus Ochoaan. Kolmantena vuonna lääketieteellisessä koulussa Ochoa päättää omistaa elämänsä biologian opiskelulle.

Toinen tutkija, jolla oli vahva vaikutus Severo Ochoaan, oli yksi hänen opettajistaan, Juan Negrin , joka oli käynyt Saksassa. Hän neuvoi Ochoaa lukemaan muita kirjoja kuin espanjaa. Tuolloin ainoa vieras kieli, jota Ochoa puhui, oli ranska, ja hänen myöhemmän päätöksensä lähteä tohtorin tutkintoon Saksaan ja Englantiin johtui halu oppia vieraita kieliä. Professori Negrin antoi Severo Ochoalle ja hänen ystävälleen José Valdecasasille mahdollisuuden tehdä tutkimusta hänen laboratoriossaan vapaa-ajallaan. Hän ehdotti, että he eristävät kreatiniinin virtsasta. Severo Ochoa kiinnostui kreatiinin ja kreatiniinin toiminnoista ja aineenvaihdunnasta. Ochoa ja Valdecasas ehdottivat yksinkertaista mikromenetelmää kreatiinin pitoisuuden määrittämiseksi lihaksissa [7] . Tämän menetelmän soveltamiseksi ja englannin kielen hallitsemiseksi Ochoa vietti 2 kuukautta Glasgow'ssa professori Noel Patonin kanssa, joka työskenteli kreatiiniaineenvaihdunnan parissa. Palattuaan Espanjaan hyvällä englannin kielen taidolla (hänellä oli luonnollinen kyky oppia kieliä), hän lähetti Journal of Biological Chemistry -julkaisuun artikkelin, jossa hän kuvasi menetelmäään kreatiinin määrittämiseksi, ja oli iloinen huomatessaan, että menetelmä hyväksyttiin pienen testauksen jälkeen. [8] . Kreatiinin tutkimus herätti Ochoan kiinnostuksen lihasten supistumisen kemiaan ja saksalaisen tiedemiehen Otto Meyerhoffin työhön fosfokreatiinin, äskettäin löydetyn yhdisteen, suhteen.

Työpaikat Saksassa ja Englannissa

Otto Meyerhof työskenteli Kaiser Wilhelm Institutessa (KWI), joka perustettiin vuonna 1910 Dahlemiin, Berliinin muodikkaaseen esikaupunkiin. Teollisille ja pankkiireille, jotka ymmärsivät, että Saksan hyvinvointi perustuu perustieteiden nopeaan kehitykseen, annettiin suuria varoja. Kaksi merkittävää biokemian hahmoa - instituutin johtaja Karl Neuberg ja Otto Warburg - työskentelivät KWI Meyerhofissa, olivat kiinnostuneita ongelmasta: kuinka ruoan potentiaalinen energia tulee solun saataville? Hän valitsi lihaksen kokeelliseksi malliksi yrittääkseen löytää yhteyttä kemiallisten muutosten ja lämmöntuotannon ja mekaanisen työn välillä. Severo Ochoa pyysi Meyerhofia antamaan hänelle mahdollisuuden viettää aikaa laboratoriossa sekä lihasten supistumisen että Saksan tutkimukseen yleensä. Hänen ilokseen hänet hyväksyttiin sinne ja hän saapui laboratorioon syksyllä 1929. Severo Ochoa ei osannut saksaa, mutta Meyerhof puhui englantia, ja kaksi kuukautta myöhemmin Severo Ochoa oppi saksaa siinä määrin, että se riitti jatkoviestintään. Fritz Lipman ja David Nachmanson ovat myös työskennelleet KWI:ssä muiden tohtoriopiskelijoiden joukossa. Yksi KWI:n merkittävistä piirteistä oli halu poistaa fysiikan, kemian ja biologian välinen este. KWI antoi valtavan sysäyksen nuorille biokemisteille, kuten Severo Ochoalle ja Fritz Lipmanille. Severo Ochoa tutki, kuinka lihasten supistukset voisivat käyttää muuta energiaa kuin hiilihydraattien hajoamisesta saatua energiaa ja vaikuttaako fosfokreatiniinin hajoaminen supistuksiin. Vastaus tuli myöhemmin (ATP:n löytämisen jälkeen), kun Loman huomasi, että fosfokreatiini regeneroi ATP:tä siirtämällä PO4:a ADP:hen. Vuoden 1929 lopulla Meyerhof muutti Dahlemista Heidelbergiin, missä Keisari Vilhelmi-seura rakensi kauniin uuden rakennuksen, johon kuului neljä tutkimuslaitosta (fysikaalinen, kemiallinen, fysiologinen ja kokeellinen lääketiede). Meyerhof nimitettiin fysiologisen instituutin johtajaksi, ja Severo Ochoa muutti hänen kanssaan Heidelbergiin. Hän palasi Madridiin vuonna 1930 tekemällä opinnäytetyön lisämunuaisten roolista lihasten supistuksessa ja meni vuonna 1931 naimisiin Carmen Cobian Garcian kanssa. Pian hän meni jälleen ulkomaille (vaimonsa kanssa) Henry Dalen laboratorioon (National Institute for Medical Research Lontoossa), missä hän työskenteli ensimmäisen entsyyminsä, glyoksylaasin, parissa pitäen yllä ystävällisiä suhteita Madridin yliopistoon. Ochoa viipyi Lontoossa kaksi vuotta ja palasi glyoksylaasitutkimuksestaan ​​lisämunuaisten rooliin lihasten supistuksessa.

1930-luvun loppu. Muutto Yhdysvaltoihin

Vuonna 1935 Ochoa ylennettiin fysiologian osaston johtajaksi uudessa Madridin instituutissa. Mutta muutamaa kuukautta myöhemmin Espanjan sisällissota alkoi , ja hän päätti lähteä Espanjasta ja palata Meyerhofiin. Kun Ochoa saapui Saksaan vuonna 1936, maa oli natsismin huipulla ja Meyerhofin asema oli epävarma. Hänen laboratorionsa kuitenkin työskenteli tuottavasti, mutta siinä tapahtui vakavia muutoksia: fysiologian laboratoriosta se muuttui biokemian laboratorioksi. Glykolyysi ja fermentaatio lihaksissa, hiivan eristäminen ja puhdistettujen entsyymien katalysoimat osittaiset reaktiot olivat pääasiallisia tutkimuskohteita. Tämä ajanjakso ei kuitenkaan kestänyt kauan, kunnes Meyerhof muutti Pariisiin elokuussa 1939 ja liittyi Biologian ja Fysikaalisen kemian instituuttiin. Ennen lähtöään Meyerhof sai Ochoalle työpaikan Plymouthin meribiologian laboratoriossa kuudeksi kuukaudeksi. Lopulta Ochoa työskenteli Rudolf Petersin kanssa Oxfordin yliopistossa. Työskentely Petersin kanssa B1-vitamiinin (tiamiinin) ja kokarboksylaasin (tiamiinipyrofosforiesteri) roolista pyruvaatin hapetuksessa on ollut erittäin tuottavaa [9] [10] . He havaitsivat, että kokarboksylaasi ja konjugoitu tiamiini ovat koentsyymejä tässä prosessissa kyyhkysten aivoissa. He osoittivat myös adeniininukleotidien tarpeen, mikä viittaa hapettumisen ja fosforylaation läheiseen rinnakkaiseloon, mikä lisäsi Ochoan kiinnostusta oksidatiiviseen fosforylaatioon. Mutta Oxford-kausi ei kestänyt kauan toisen maailmansodan vuoksi. Laboratoriota käytettiin sotatöihin, ja ulkomaalaisena Ochoa sai potkut. Hän päättää matkustaa Yhdysvaltoihin ja kirjoittaa Carl ja Gertie Coreylle ( Washington University School of Medicine St. Louisissa ); he vievät hänet sinne. Corey löytää rahoitusta, ja elokuussa 1940 Carmen ja Severo Ochoa purjehtivat Yhdysvaltoihin. Carl ja Gertie Coreyn laboratorio oli hämmästyttävä paikka: painopiste oli entsyymeissä, erityisesti glykogeenifosforylaasissa. Ochoa oppi paljon, vaikka hänen oma työnsä entsymaattisesta mekanismista fruktoosin muuntamiseksi glukoosiksi maksauutteessa oli melkoinen pettymys. Hän kuitenkin ymmärsi entsyymieristys- ja karakterisointitekniikoiden merkityksen ja hallitsi ne. Vuonna 1942 hän aloitti tutkimusassistenttina New Yorkin yliopiston lääketieteellisessä tiedekunnassa (NYU).

Väliaineenvaihdunta

Ochoa työskenteli kaksi vuotta New Yorkin yliopiston lääketieteellisessä korkeakoulussa, minkä jälkeen hän muutti kadun toisella puolella sijaitsevaan vanhaan rakennukseen biokemian osastolle, jossa hän otti biokemian apulaisprofessorin paikan. Kaksi vuotta myöhemmin hänestä tuli farmakologi. Myös farmakologinen tiedekunta sijaitsi vanhassa rakennuksessa ja siellä oli uusia laboratorioita, joten Severo Ochoa hankki lisää tilaa ja laajensi toimintaansa rekrytoimalla tutkinnon suorittaneita opiskelijoita ja työntekijöitä. Hänen ensimmäinen tutkimuksensa New Yorkin yliopistossa koski oksidatiivista fosforylaatiota. Aiemmin Oxfordissa Severo Ochoa osoitti, että hapettuminen liittyy AMP:n fosforylaatioon ATP:ksi sen jälkeen, kun fosfori on siirtynyt ATP:stä sokeriin [11] . Fosforylaation ja pyruvaatin hapettumisen pakollinen rinnakkaiselo, jonka myös Belitzer Neuvostoliitossa ja Kalkar Tanskassa osoittivat, on merkittävä löytö. Sydänhomogenaattia käyttäen hän määritti esteröidyn fosforin atomisuhteen kulutettuun happeen (P/O-suhde). Sydänuutteen palorypälehapon hapettumisen aiheuttaman fosforylaation vertaaminen palorypälehapon ja fosfoglyseriinihapon dismutaation aiheuttamaan fosforylaatioon antoi ensimmäiselle reaktiolle P/O = 3 [12] . Aikaisemmin se oli 2; alhainen P/O-arvo johtui ATPaasin aiheuttaman ATP-hydrolyysin aiheuttamista häviöistä. A. Lehninger vahvisti edelleen arvon 3 käyttämällä mitokondrioita. Suoritettuaan tämän työn Severo Ochoa uskoi, että oksidatiivisen fosforylaation mekanismia ei voitu ymmärtää ilman lisätietoa hapettumisen aikana tapahtuvista entsymaattisista reaktioista, erityisesti niistä, jotka liittyvät fosforylaatioon. Kuten Krebsin ansiosta tiedettiin, trikarboksyylihapposykli on tärkein ruoan hapettuminen solussa, ja Keelin ja Warburg osoittivat työssään, että pyridiininukleotidit, flavoproteiinit ja sytokromit ovat mukana tässä prosessissa. Ochoa valitsi isolimondehydrogenaasin tutkittavaksi.

Tiedettiin , että isositraatti muodostui sitraatista cis-akonitaatin avulla, mutta α-ketoglutaraattiin johtavaa reaktiota ei todistettu, vain ennustettiin, ja Ochoa päätti valmistaa oletetun välituotteen "oksalomeripihkahapon", jonka hän saavutti useiden kokeiden jälkeen. epäonnistuneita yrityksiä. Aloittaen oksalomeripihkahaposta, hän havaitsi α-ketoglutaraatin muodostumista ja päätteli, että oksalomeripihkahappo oli todellakin välituote tässä reaktiossa. Sillä välin biokemistit ovat hämmästyneet CO 2 :n kiinnittymisen ilmiöstä, joka tapahtuu heterotrofisessa bakteerissa, kuten Wood ja Werkman ovat osoittaneet. Ochoa tuli siihen tulokseen, että isolimondehydrogenaasin reaktio on palautuva ja määrittää CO 2 -kiinnitysprosessin mekanismin eläinsoluissa. Severo Ochoa -laboratoriossa ei ollut isotooppeja käyttäviä laitteita; hän päätti, että hän voisi tutkia reaktiota, jonka pitäisi johtaa NADPH:n hapettumiseen spektrofotometrialla, jos isositraatti muodostuu CO 2 :n kiinnittymisellä α-ketoglutaraattiin. Kuten hän kuitenkin kirjoittaa vuosikatsauksissa, hän ei uskonut sen toimivan ja viivytteli kokeilua, kunnes Evraim Rucker rohkaisi häntä. Jälkimmäinen työskenteli mikrobiologian osastolla alakerroksessa, ja heidän välillään käytiin paljon keskusteluja. Kun Ochoa lopulta suoritti kokeen ja näki spektrofotometrin neulan liikkuvan, mikä osoitti NADPH:n hapettumista [13] , hän oli niin järkyttynyt onnesta, että juoksi ulos ja huusi: "Mene katsomaan, kuinka spektrofotometrin neula liikkuu!". Mutta koska kello oli jo yhdeksän illalla, lähellä ei ollut ketään. Spektrofotometri, jolla koe suoritettiin, lahjoitettiin American Philosophical Societylle, ja se oli tarkoitus palauttaa vuotta myöhemmin, mutta kokeiden onnistuminen ja spektrometrin tarve jatkotyötä varten pakottivat Seuran sallimaan Ochoan pitää instrumentin. Sen jälkeen hänestä tulee virtuoosi oksidatiivisten entsyymien spektrofotometrisessa tutkimuksessa; usein tutkittava reaktio voitiin kytkeä kolmeen tai neljään muuhun entsymaattiseen reaktioon, kunnes ketju oli valmis, ja NAD- tai NADP-riippuvaiset reaktiot, joissa pyridiininukleotidit hapettuivat tai pelkistettiin, voisivat tarjota perustan jatkuvalle entsyymiaktiivisuuden spektrometriselle tutkimukselle. Tämä spektrofotometri oli pitkään ainoa koko tiedekunnassa - menestyneet amerikkalaiset laboratoriot eivät olleet niin hyvässä kunnossa kuin joskus näytti.

Tänä aikana Severo Ochoalla oli ensimmäinen jatko-opiskelija, Alan Mehler, sekä kaksi jatko-opiskelijaa: Santiago Grisolia ja Arthur Kornberg. Eräänä päivänä Alan, tarkkaillessaan pyruvaatin muodostumista malaatista, huomasi malaatin nopean hapettumisen, kun NADP:tä lisättiin kyyhkysenmaksauutteeseen. Tämä johti "omena"-entsyymin - malaattidehydrogenaasin - löytämiseen [14] . Entsyymi katalysoi palautuvaa reaktiota:

malaatti + NADP ↔ pyruvaatti + CO 2 + NADPH + H.

"Omena"-entsyymi katalysoi myös pyruvaatin muodostumista oksaloasetaatista, jolloin vapautuu C02 ja pelkistyy NADPH-malaatti. Se toimii koentsyymi A:n ja NADPH:n välittämässä rasvahappojen hapetuksessa. He päättelivät, että se oli yksi entsyymi, jossa on kaksi aktiivista kohtaa. Tämä muistutti heitä isositrisesta dehydrogenaasireaktiosta ja johti heidät siihen johtopäätökseen, että isositrisella dehydrogenaasilla, joka katalysoi kahta reaktiota, kuten aiemmin mainittiin, on myös kaksi aktiivista kohtaa: toinen isositraatille , toinen oksalomeripihkahapon hapetukselle ja että se on ei kahden entsyymin - isolimon-dehydrogenaasin ja oksalosukkiinidehydrogenaasin - seos, kuten aiemmin ajateltiin.

Wolf Vishniak ja Ochoa käyttivät "omena"-entsyymiä pyruvaatin pelkistävään karboksylaatioon malaatiksi granaattipinaatin ja NADPH:n läsnä ollessa [15] . Tämä oli ensimmäinen osoitus pyridiininukleotidien fotokemiallisesta pelkistämisestä kloroplastivalmisteilla. Vuonna 1948 Joe Stern, Hans Krebsin entinen jatko-opiskelija, muutti Severo Ochoan laboratorioon tieteiden tohtorin arvolla. Ochoa päättää, että on aika työstää Krebsin syklin mielenkiintoisinta entsyymiä, joka tekee sitraattia oksaloasetaatista ja aktiivisesta asetaatista. Se tunnettiin "tiivistyvänä" entsyyminä. Eläinkudosuute oli kuitenkin inaktiivinen sitraattisynteesissä, mutta he eivät menettäneet sydämensä ja uskoivat tämän johtuvan entsyymin liukenemattomuudesta. He muuttivat bakteeria toivoen entsyymin liukenevan. Severo Ochoan tunnusmerkki oli ongelman ratkaisemiseen parhaiten soveltuvien organismien käyttäminen. Lopuksi, yhdistämällä Escherichia colin ja sian sydämen uutteet, ne saavuttavat hyvän sitraatin synteesin asetyylifosfaatista ja oksaloasetaatista katalyyttisten määrien koentsyymi A läsnä ollessa. Kuten Earl Stadtman myöhemmin totesi, E. coli -uute "suojaa" "transasetylaasientsyymi. Tämä entsyymi katalysoi asetyyliryhmän siirtymistä asetyylifosfaatista koentsyymi A:ksi, jolloin muodostuu asetyyli-CoA + PO4. Sian sydänuute suojaa kondensoivaa entsyymiä. He puhdistivat kondensoivan entsyymin homogeeniseen tilaan ja Ochoa kiteytti sen lisäämällä muutaman tippa ammoniumsulfaattia [16] . Hän oli erittäin ylpeä ja kuvasi kiteitä. Myöhemmin, yhteisessä tutkimuksessa Feodor Linenin kanssa, hän osoitti, että kondensoiva entsyymi katalysoi asetyyli-CoA:n ja oksaloasetaatin palautuvaa konversiota CoA+sitraatiksi [17] . Ochoa oli todella kiinnostunut pyruvaatin hapettumisen alkuvaiheista. Samaan aikaan Irvin Gonzalus työskentelee jonkin aikaa apurahan parissa ja tutkii yhdessä Seymour Corquesin ja Alice del Campillon kanssa pyruvaatin hapettumista Escherichia colissa [18] . Ymmärtäessään asetyyli-CoA:n merkityksen aineenvaihdunnan välituotteena Ochoan laboratorio alkoi tutkia tärkeää rasvahappoaineenvaihdunnan kysymystä. CoA-transferaasin löysivät Joe Stern ja Minor Kuhn [19] . Joe Stern tunnisti myös krotonaasientsyymin, jonka Alice del Compiglio kiteytti. Krotonaasi katalysoi β-hydroksibutyryyli-CoA:n dehydraatiota muodostaen krotonyyli-CoA:ta. Crotonil CoA muunnetaan edelleen butyryyli CoA:ksi. Tämä entsyymi on läheistä sukua yhdisteelle, joka syntyy parittomien rasvahappojen ja joidenkin aminohappojen hapettumisesta.

On myös ollut useita raportteja siitä, että propionaatin hapettumiseen liittyy hiilidioksidin kiinnittyminen ja se johtaa sukkinaatin muodostumiseen . Severo Ochoa pyytää Martin Flavinia, joka on liittynyt ryhmään, tutkimaan prosessia. Flaviini havaitsi sian sydänuutetta käyttäen, että tämä uute muuttaa propionaatin dikarboksyylihapoksi, mutta tämä happo ei ole meripihkahappoa, vaan metyylimalonaattia [20] [21] . M. Flavinin, J. Casiron, E. Leonen, P. Langielin, R. Matsunderin ja muiden työ osoittaa, että propionaatti muunnetaan ensin propionyyli-CoA-karboksylaasiksi, biotiinia sisältäväksi entsyymiksi; sitten metyylimalonyyli-CoA isomeroituu A- ja B-muotoihin. B-muoto antaa sukkinyyli-CoA:ta metyylimalonyylimutaasista [22] ; mutaasi on B12-entsyymi. Casiron kiteyttämä propionyyli-CoA-karboksylaasi karboksyloituu ja siirtää karboksyyliryhmän propionyyli-CoA:ksi.

Mielenkiintoinen trikarboksyylihapposyklientsyymi, jonka Kaufman löysi pinaatista, katalysoi ATF:n synteesiä ADF:stä, Pi:stä ja sukkinyyli-CoA:sta. Sukkinyyli-CoA deasetyloitiin sitten sukkinaatiksi ja CoA:ksi [23] [24] . Entsyymi nimettiin fosforyloivaksi entsyymiksi tai P-entsyymiksi ja sitten sukkiinitiokenaasiksi. P-entsyymi osallistuu osamaan fosforylaatioon, joka seuraa ketoglutaraatin dekarboksylaatiota Krebsin syklissä. Tämä entsyymi sai Ochoan palaamaan oksidatiivisen fosforylaation tutkimukseen.

Polynukleotidifosforylaasi

Vuonna 1955 hän eristi yhdessä jatko-opiskelija Marianna Grünberg-Managon (Venäjältä kotoisin oleva, myöhemmin tunnettu biokemisti, joka työskenteli Ranskassa) kanssa Azotobacter vinelandi -mikro-organismista uuden entsyymin, joka katalysoi samanlaisen molekyylin synteesiä in vitro . RNA:han, joka koostuu 4, 3, 2 ja jopa yhdestä typpipitoisesta emäksestä. Entsyymille annettiin nimi "polynukleotidifosforylaasi". Huolelliset kokeet ovat osoittaneet, että synteettinen polyribonukleotidi muistuttaa kooltaan luonnollista RNA:ta. Sen molekyylipaino vaihteli välillä 30 000 - 1-2 x 106 Da. Myös sedimentaatiovakiot olivat samanlaiset. Luotettavan RNA-synteesireaktion suorittamiseksi vaadittiin erittäin puhdasta entsyymiä, jota varten käytettiin kromatografiaa. Lisäksi synteesin aloittamiseksi oli tarpeen lisätä liuokseen pieni määrä oligomeeriä, jolloin polymeeriketju kasvaa. Kun syntetisoitua RNA:n kaltaista polymeeriä käsitellään haiman ribonukleaasilla, saadaan oligonukleotidien seos, sama kuin silloin, kun luonnollinen RNA pilkotaan samanlaisissa olosuhteissa. Kokeissa syntetisoidun polymeerin hydrolyysillä käärmeen myrkystä ja pernakudoksesta eristettyä fosfodiesteraasia käyttäen osoitettiin, että kokeellisesti saatu RNA on lineaarinen ketju, jonka nukleosidiyksiköt on liitetty toisiinsa 3,5'-fosfodiesterisilloilla. Kaksi vuotta myöhemmin Arthur Kornberg eristi DNA-polymeraasientsyymin Escherichia colista ja käytti sitä DNA:n syntetisoimiseen. Vuonna 1959 molemmat tiedemiehet palkittiin Nobel-palkinnolla [25] [26] [27] [28] .

Geneettinen koodi

Polynukleotidifosforylaasin löytämisen jälkeen Severo Ochoan laboratorio on keskittynyt pääasiassa kahteen asiaan: propionaattihapettumiseen, jota Martin Flavinin lähdön jälkeen tulleet lääkärit tutkivat, ja itse polynukleotidifosforylaasiin. Ochoa työskenteli uuden japanilaisen tiedemiehen Sanai Mi:n kanssa fuusioreaktion parissa toivoen, että entsyymin lisäpuhdistuksen myötä alukkeen tai templaattien rajoitukset selkiytyisivät. Itse asiassa tämä oli ainoa kerta, kun proteolysoiva entsyymi tarvitsi alukkeen polymeerisynteesiä varten. Vaikka nämä tutkimukset eivät ole osoittautuneet hyödyllisiksi tulevaisuudessa määritettäessä entsyymin roolia in vivo , ne ovat olleet erittäin hyödyllisiä monien polymeerien synteesissä. Siten Ochoan laboratorio oli valmis geneettisen koodin in vitro -kokeisiin .

mRNA:n yleinen käsite muotoiltiin 1960-luvulla, ja vuonna 1961 Nirenberg ja Mattai raportoivat kansainvälisessä biokemian kongressissa Moskovassa, että Escherichia coli -uute siirtää polyuridylaatin (poly U) polyfenyylialaniiniksi. Tämä oli kongressin jännittävin uutinen, jonka jälkeen kävi selväksi, että geneettisen koodin tutkimuksen kokeiluille avautui laaja kenttä. Seuraavina kuukausina alkoi kilpailu Ochoan ja Nirenbergin laboratorioiden välillä tutkiakseen erilaisten kopolymeerien vaikutusta aminohappoyhdistelmiin. Laskemalla heteropolymeereissä olevien triplettien tilastollinen rakenne, oli mahdollista määrittää niiden suhde useimpien aminohappojen osalta [29] [30] . Peter Lengiel, Joe Speyer, Wendy Stanley ja Albert Wabha olivat mukana, mutta Ochoa johti projektia henkilökohtaisesti, ja tiedekunnan tekniset resurssit omistettiin kokonaan syntetisoimaan niin monia yhdisteitä, joita dekoodaustyö tarvitsi.

Siten ei kestänyt kauan tunnistaa kutakin 20 aminohaposta koodaavia triplettejä, eikä kestänyt kauan osoittaa, että koodi oli monissa tapauksissa käänteinen, jotkut tripletit koodaavat samoja aminohappoja. Aminohapot määrittävän triplettisekvenssin määrittivät Phillip Leder ja Marshall Nirenberg havaittuaan, että spesifiset emästriplettisekvenssit helpottavat spesifisten aminoasyyli-tRNA:iden sitoutumista ribosomiin. Tämä ilmoitettiin kansainvälisessä biokemian kongressissa New Yorkissa vuonna 1964. Vastaavan mRNA:n kemiallisella eristyksellä Gobin Khoran vahvisti kauniisti aminohappojen koodin käyttämällä oligooksiribonukleotidisynteesiä ja transkriptiota RNA-polymeraasia käyttäen. Sidney Brennerin Cambridgessa ja Garenin Yalen alkuperäisissä geneettisissä kokeissa löydettiin terminaalikolmosia. Cambridgen markkeri havaitsi, että AUG on kodoni, joka aloittaa ketjun. Severo Ochoa -laboratorio määritti, että lukusuunta oli 5' - 3' [31] [32] käyttämällä polynukleotideja, jotka alkoivat AUG:stä tai muusta polynukleotidifosforylaasilla valmistettuun kodonista . Hän määritti myös in vitro , että UAA on yksi terminaalisista kodoneista [33] .

Aloittaa geenit proteiinisynteesiä varten

Kolme ryhmää kerralla - Margarita Salas ja Stanley Ochoassa, Eisenstadtissa ja Bravermann sekä Revel Grossin kanssa havaitsivat, että luonnollinen mRNA, kuten bakteriofagien MS2 ja QB, siirtyvät puhdistamattomien Escherichia colin ribosomien ja 0,5 tai 1 M ammoniumsulfaatilla pestyjen ribosomien kautta. ei siirretä.. Pestyt ribosomit sietävät kuitenkin helposti polyA:ta tai polyU:ta, mutta eivät AUG:lla alkavia polymeerejä, jotka käyttäytyvät kuin luonnolliset mRNA:t. Havaittiin, että ammoniumsulfaatti huuhtelee pois sen sisältämän proteiinigeenin, jota kutsutaan "aloitusgeeniksi", joka on välttämätön luonnollisen mRNA:n tai polynukleotidien siirtämiseksi alkaen AUG:stä [34] [35] . Kaksi ensimmäistä geeniä ja myöhemmin kolmas eristettiin ja niitä kutsutaan nykyään IF1:ksi, IF2:ksi ja IF3:ksi [36] . Samaan aikaan Clarke ja Marker osoittivat, että bakteerien polypeptidiketjut alkavat spesifisellä metyyli-tRNAfMet:llä, joka esteröi metioniinia, joka puolestaan ​​muodostuu ja löytyy polypeptidiketjusta terminaalisessa amiiniasemassa. AUG koodaa metyyli-tRNAfMetiä, ja spesifinen formylaasi ei pysty tuottamaan metyyli-tRNAfMet-pidentää. IF1:n ja IF3:n roolien ymmärtäminen ja tapahtumasarja, joka johtaa kompleksin muodostumisen alkamiseen E. colissa, on ollut kiistanalaista ja kiistanalaista jopa Ochoan ryhmässä. Nyt tämä on selvää monien tutkijoiden tutkimuksen ansiosta.

1970-luvun alussa Ochoa siirtyi eukaryoottien translaation aloittamisen tutkimiseen [37] . Richard Sweet löysi ensimmäisenä initiaatiogeenit eukaryooteista vuonna 1968. IF2-analogeja eristettiin sitten useissa laboratorioissa (Daniel Levin, Theo Staelin, Naba Gupta). eIF2, kuten sitä nykyään kutsutaan, koostuu kolmen polypeptidin ketjusta, ja sen tehtävänä on muodostaa kolmikomponenttinen kompleksi GTP:stä ja tRNA-initiaattori metyyli-tRNA:sta, joka ei tuota metioniinia. Tämä tRNA on kuitenkin erillinen metyyli-tRNA:n jatkajasta. 40S-ribosomialayksiköiden läsnä ollessa kolmiosainen kompleksi synnyttää 40S-aloituskompleksin. Samaan aikaan joidenkin muiden ryhmien (Lontoo, Wurma) kanssa Ochoa ja de Haro eristivät proteiinigeenin, jota he kutsuivat ESP :ksi [38] ; Tällä proteiinilla oli monia nimiä riippuen ryhmästä, joka sen löysi, mutta nyt sitä kutsutaan nimellä EiF2B. Sen toimintatapa selitettiin paljon myöhemmin. Se katalysoi GTP:n ja GDP:n välistä vaihtoreaktiota, eristää BKT:n ja korvaa sen GTP:llä. eIF2B eristettiin työskennellessään hemin roolia globiinin synteesissä retikulosyyttilysaatilla. Hemi estää pienten eIF2α-alayksiköiden fosforylaatiota tietyllä kinaasilla [39] . Kun eIF2a on fosforyloitu, se sitoutuu stabiilisti kolmikomponentiksi kompleksiksi ja estää eIF2B:n vapautumisen katalysoidusta vaihtoreaktiosta. Mekanismi on, että eIF2B on suurempi kuin eIF2, joten vain eIF2:n osittainen fosforylaatio riittää estämään eIF2B:tä toimimasta eristämällä sitä.

Viruksen RNA-replikaatio

Severo Ochoa oli kiinnostunut entsyymistä, joka vastaa RNA:n synteesistä viruksen RNA-genomissa, ja kun Charles Weissman tuli hänen tiedekuntaansa vuonna 1961, hän ehdotti, että hän ryhtyisi RNA:n replikaatioon. Aluksi Weissmann alkoi yhdessä Joe Krakovan kanssa tutkia tupakan mosaiikkiviruksen RNA:n replikaatiota pinaatin lehdissä, mutta siirtyi pian f2- tai MS2-RNA:lla infektoituneeseen E. coliin [40] . Ochoa oli aina kiinnostunut työstä, mutta ei itse osallistunut siihen. Monet tiedemiehet liittyivät Weissmaniin eri aikoina, kuten Martin Billeter, Roy Burdon ja Peter Borst. Kilpailu järjestettiin Weissmanin, Spiegelmanin ja Augustin ryhmien välillä. Viruksen RNA-synteesin mekanismin selittäminen oli vaikea tehtävä, koska entsyymi ei ollut liukoinen. Lopulta Qβ-virus oli paras valinta. Qβ-RNA-polymeraasi puhdistettiin homogeeniseen tilaan ja spesifiset rajoitukset Qβ-RNA-templaatille osoitettiin. Vuonna 1968 kaikki kolme ryhmää tapasivat ja päätyivät yhteiseen johtopäätökseen RNA:n replikaation mekanismista. Ensimmäisessä vaiheessa matriisin plus-ketjuun muodostetaan miinusketju ja välituotteella on avoin rakenne. Malli ja tuote eivät muodosta kaksoiskierrettä, vaan ne pidetään yhdessä replikaation aikana. Rakenne romahtaa kaksijuosteisessa rakenteessa vain, kun proteiinit uutetaan. Replikaation toisessa vaiheessa negatiivista juostetta käytetään templaattina plus-juosteen synteesiä varten. Tämä kompleksi on samanlainen kuin ensimmäinen, vain matriisi koko pituudelta on miinusketju.

Viime vuodet

Kesällä 1974 69-vuotias Ochoa jäi eläkkeelle biokemian tiedekunnan dekaanin tuolista. Hänellä oli tarjous liittyä Nutleyssa sijaitsevaan Rocher Institute for Molecular Biology -instituuttiin. Hän hyväksyi sen ja jatkoi vuoteen 1985 saakka työtään GTP/GDP-vaihtogeenin parissa eukaryooteissa ja fosforylaation roolista eukaryoottien initiaatiossa J. Sikerkan kanssa. Vuonna 1985 hän ja Carmen palasivat Espanjaan, missä hän jatkoi Madridin yliopiston molekyylibiologian keskuksen kunniajohtajana. Keskus perustettiin hänen johdolla ja on nyt yksi johtavista molekyylibiologian keskuksista. Carmenin kuolema vuonna 1986 tuhosi hänet, eikä hän koskaan toipunut tästä shokista, koska hän oli menettänyt elämän tarkoituksen. Hän kuoli seitsemän vuotta sen jälkeen, marraskuussa 1993 Madridissa. Hänet haudattiin Luarcaan, kaupunkiin, jossa hän syntyi.

Johtopäätös

Severo Ochoan elämä on opettavaista, ja se voidaan nähdä tiivistelmänä koko modernin biokemian historiasta. Hän halusi puhua työstään ryhmässä, hänellä ei ollut salaisuuksia siitä. Heti kun hänestä tuli biokemisti, hän veti puoleensa oppimista ja sitä varten hän oli monissa laboratorioissa. Kuten hän itse sanoi itsekseen, hän ei ollut huolissaan pysyvästä paikasta ja oli yllättynyt koko ajan. Ensimmäinen asema työntekijöiden kanssa tuli hänelle vasta 39-40-vuotiaana. Biokemia oli hänen harrastuksensa [41] , mutta Carmen yritti löytää tasapainon työn ja vapaa-ajan välillä elämässään. Carmen on luultavasti myös vastuussa siitä, että hän, joka rakastaa musiikkia, jäi harvoin konserteista väliin. Hän piti myös taidenäyttelyistä, teatterista ja hyvistä ravintoloista. Ochoalla oli aina eurooppalaisen herrasmiehen aristokraattinen käytös ja käytös, ja hän oli harvoin jännittynyt, mutta aina horjumaton tulosten tulkinnassa, paperien kirjoittamisessa ja kirjailijoiden priorisoinnissa syntyneissä konflikteissa. Kuten kuka tahansa patriarkka, hän oli hyvin järkyttynyt, kun hänen parhaat opiskelijansa ja henkilökuntansa lensivät hänen siipiensä alta itsenäiseen elämään. Huolimatta siitä, että hänestä tuli Yhdysvaltain kansalainen ja hän nautti elämästä tässä maassa, hän säilytti erityisen rakkauden Espanjaa kohtaan ja melkein aina työskenteli espanjalainen ryhmässään. Tämä rakkaus oli molemminpuolista: vaikka hän asui ulkomailla, hän oli epäilemättä yksi maansa kuuluisimmista ihmisistä. Useimmissa espanjalaisissa kaupungeissa on katu, joka kantaa hänen nimeään, hänen muotokuvansa on nähtävissä Madridin ravintolassa, jossa hän halusi käydä, Valenciassa on hänen kollegansa Santiago Grisolian luoma museo ja hänen kuvansa on Barcelonan vahamuseossa. . Hän antoi sysäyksen monien opiskelijoidensa uralle Arthur Kornbergista Charles Weissmaniin, joista monista tuli kuuluisia tiedemiehiä.

Severo Ochoa on saanut lukuisia palkintoja. Hän oli Yhdysvaltain kansallisen tiedeakatemian, American Academy of Sciences and Arts: n jäsen, Lontoon kuninkaallisen seuran ulkomainen jäsen ja Neuvostoliiton tiedeakatemian ulkojäsen. Hänellä oli 36 kunniatohtorin arvoa ja yli sata mitalia ja palkintoa. Hän oli myös Kansainvälisen biokemistien liiton puheenjohtaja vuosina 1961–1967 ja sai Nobel-palkinnon vuonna 1959.

Marianne Grünberg-Managon muistelmat [6]

Tapasin Severo Ochoan ensimmäisen kerran vuonna 1952 Pariisissa toisessa kansainvälisessä biokemian kongressissa. Pitkä ja komea hän oli silloin 47-vuotias; hän näytti espanjalaiselta Hidalgolta, jolla oli villit ruskeat silmät ja valkoiset hiukset. Sorbonnessa Ochoa teki vahvan vaikutuksen selkeällä ja informatiivisella luennolla CO2:n kiinnittymisestä substraatin hapettumisen aikana ja esitti kauniita kondensoituneen entsyymin kiteitä. Hänen nimensä tunnettiin hyvin Ranskassa, mutta pääasiassa kirjallisuudesta, sillä Eurooppa oli vasta toipumassa sodasta ja kansainvälisiä tapaamisia oli vähän. Se oli ensimmäinen tällainen konferenssini, joten olin huolissani. Tuolloin jatko-opiskelijana tajusin, että haluan tehdä tutkimukseni hänen laboratoriossa, ja ohjaajani Evgeny Abel esitteli minut hänelle. Severo Ochoa puhui sujuvaa ranskaa, ja olin järkyttynyt, kun hän hyväksyi siirtoni hänelle New Yorkin yliopistoon ja ajoitti syyskuun 1953 aloituksen. Sovimme, että vietän ensin muutaman kuukauden Irving Gonzalusin laboratoriossa Urbanassa. Ochoa oli erittäin tyytyväinen, että hän sai jatko-opiskelijan ja että minä ihailen Gonzaluksen työtä. Jälkimmäinen hyväksyi suunnitelman.

Kun saavuin Severo Ochoan laboratorioon syyskuussa 1953 muutaman kuukauden entsymologian koulutuksen jälkeen Gonzalus-laboratoriossa, se oli vielä vanhassa rakennuksessa (siirretty uuteen kesällä 1954). Olin pettynyt, varsinkin kun astuimme laboratorioon, meidän piti käydä läpi anatomiahuoneen, jossa lääketieteen opiskelijat leikkaavat ruumiita. Mutta laboratoriossa oli erittäin ystävällinen ilmapiiri: se oli tungosta, mutta erittäin hyvin järjestetty. Huoneissa oli kaikki tarvittava, jotta kaikki tuntevat olonsa itsenäisiksi ja tyytyväisiksi. Pääteknikko Morton Schneider ja Peter Lozina vastasivat koelaitoksesta, ja jos sinulla oli ongelmia, voit aina kääntyä Mortonin puoleen, joka ratkaisi sen nopeasti. Ryhmä oli melko pieni: Joe Stern, Alice del Campillo, Seymour Kaufman ja kreikkalainen, jolla on tutkinto, S. Alvisatos. Myös tiedekunnassa, vaikkakin melko erillään, oli Charlie Gilvard, joka käsitteli lysiiniä ja tutki diamiineja. Hänellä oli kriittisin ja mielikuvituksellisin ajattelutapa. Sarah Ratner oli myös riippumaton tiedemies, joka työskenteli Krebsin ureasyklin entsymaattisten vaiheiden parissa. Martin Flavin ja Bill Jacobi, jotka työskentelivät muurahaishydrogenaasin kanssa, tulivat myöhemmin. Toinen jatko-opiskelija, Ernie Rose, ilmestyi samaan aikaan kuin minä. Severo Ochoa saapui yleensä klo 9 ja lopetti klo 7, ja hänen toimistonsa ovi oli lähes aina auki. Britanniassa hän oppi työskentelemään tuottavasti käyttämättä siihen paljon aikaa. Hän keskusteli kokeesta eri ryhmien kanssa joka päivä. Kun tulin laboratorioon, siellä oli perinne, jota Ochoa yritti pitää kiinni, että kaikki kokoontuivat lounaalle, ja jokainen, kuten Amerikassa on tapana, oman voileivän kanssa. Tämä tapahtuma pidettiin yhdessä laboratorion huoneista. Minusta ja Erniestä se tuntui tylsältä ja muodolliselta, ja päätimme erottaa itsemme muista ja mennä kahvilaan. Kaksi päivää myöhemmin Ochoa sai meidät kiinni ja kysyi: "miksi en näe sinua lounaalla?". Vastasimme, että käymme mieluummin kahviloissa ja että olimme jo kyllästyneet voileipiin, johon hän vastasi: "Kuinka siistiä, voinko mennä kanssasi?". Siitä päivästä lähtien hän söi kanssamme, ja sitten muut liittyivät mukaan. Laboratorion ilmapiiri, kuten toisinaan tapahtuu, on täysin muuttunut: siitä on tullut epävirallinen, rento, kyllästynyt tiedonvaihdolla sekä tieteellisistä että arkipäiväisistä asioista. Keskustelut olivat erittäin mielenkiintoisia: joku saattoi esittää kysymyksiä tai keksiä tekniikan, ja ihailin Ochoan kykyä luoda erittäin tieteellistä ja rauhallista tunnelmaa näillä lounailla. Lauantaisin kävimme eri ravintoloissa ja oli myös kahvitauko ja kakkuja puolenpäivän aikaan, jolloin saimme jatkaa keskustelua.

Ennen saapumistani laboratorio oli varustettu isotooppien kanssa työskentelemiseen. P-entsyymireaktion mekanismi ymmärrettiin nopeasti tutkimalla vaihtoreaktiota 32-fosforileimatun ADP:n tai ATP:n ja sukkinaattileimatun sukkinyyli-CoA:n välillä. Nämä tutkimukset osoittivat fosforylaation välituotteita ja johtivat ymmärrykseen reaktiomekanismin yksityiskohdista. Käytetty menetelmä oli erittäin lupaava, ja Severo Ochoa halusi soveltaa sitä muihin fosforylaatioon liittyviin reaktioihin. Erityisesti hän uskoi, että oli tullut aika tutkia sen ajan keskeistä ja perusongelmaa: ATP-synteesiä, joka tapahtuu oksidatiivisen fosforylaation aikana. Tämän prosessin mekanismin ongelmaa käsittelivät arvostetuimmat ja suuret ryhmät (Green, Boyer, Lehninger , Dardy, Rucker, Conn), jotka kilpailevat keskenään. Ennen kuin Severo Ochoa antoi prosessin uusille tutkijoilleen (Ernie ja minä), hänen oli testattava kykymme puhdistaa entsyymejä ja tutkia niiden ominaisuuksia. Joten hän aloitti toisesta häntä kiinnostavasta ongelmasta: asetokinaasin aiheuttamasta asetaattifosforylaatiosta (ilman CoA:ta välituotteena):

asetaatti + ATP ↔ asetyyli PO4 + ADP.

Hän antoi meille pullon kuivattua E. colia, ja tajusimme, että meidän oli työstettävä asetokinaasin puhdistusta ja mekanismia sen sisältämän aineen kanssa. Tuolloin tuottavia proteiinien fraktiointitekniikoita, kuten varauksenvaihtoa ja Sephadex-kromatografiaa, ei ollut vielä kehitetty. Puhdistus koostui fraktioinnista suolalla orgaanisessa liuottimessa alhaisessa lämpötilassa ja eluoimisesta erilaisista geeleistä, kuten kalsiumfosfaatista. Muistan kuinka monta E. coli -solua tuhlasimme, kunnes opimme suorittamaan toimenpiteen oikein. Seuraavaksi tutkimme mekanismia, jossa siemenessä oleva entsyymi sitoutuu samanaikaisesti fosfaatin luovuttajaan ja vastaanottajaan sen jälkeen, kun entsyymi vaihtaa fosfaattia [25] . Mekanismissa ei ollut fosforyloitua välituotetta, eikä mekanismi tehnyt meihin suurta vaikutusta, mutta puhdistuksen ja entsymologian koulutus oli meille hyödyllistä ja entsyymejä tarvittiin. Terri Stadtmanin, joka työskenteli laboratoriossa jonkin aikaa, ehdotuksesta kehitin menetelmän asetaatin määrittämiseksi asetokinaasilla, ja Terri käytti sitten tätä menetelmää joissakin tutkimuksissaan [25] .

Muistan ilolla sitä yhteistyöaikaa Ernie Rosen kanssa. Kokeilujakson läpäisimme onnistuneesti ja joulun aikoihin Severo Ochoa päätti uskoa meille "unelmaprojektinsa" - oksidatiivisen fosforylaation. Ernie Rose päätti testata sitä rotan mitokondrioissa. Koska hän kiehtoi Paul Boyerin ja Milred Cohnin 18O-isotooppien vaihtoa koskevaa työtä, hän halusi soveltaa menetelmää tutkimukseensa. En halunnut tappaa rottia ja päätin tutkia prosessia bakteereilla. Päätin, että valitsemalla erityisesti aerobisia bakteereja, kuten Azotobacter vinelandia, jotka hapettavat aktiivisesti hiilihydraatteja, voisin paremmin eristää aktiivisen järjestelmän ATP-synteesiä ja hapettumista varten. Ymmärsin, että olisi vaikeaa havaita puhtaan PO4:n ottoa fosfaatilla kontaminoituneista bakteeriuutteista ja erilaisia ​​niiden ottoa tai vapautumista seuraavia reaktioita, joten päätin käyttää PO4:n ja ATP:n välistä vaihtoreaktiota (joka on hyvin perehtynyt tähän asetokinaasin tutkimisen jälkeen). menetelmä mielenkiintoisten uusien fosforyloitujen koentsyymien eristämiseksi. Ajatus, joka nyt näyttää naiivilta, oli, että reaktio, jossa liukoinen koentsyymi X, joka fosforyloituisi tietyllä entsyymillä ATP-synteesin aikana, olisi hyvin yksinkertainen:

ATP + X ↔ XP + ADP ↔ ADP + P + X.

Tietenkin tarkkailin vaihtoa 32PO4:n ja ATP:n kahden terminaalisen fosfaattiryhmän välillä Azotobacter vinelandi -uuteliuoksessa ja aloin puhdistaa vaihdosta vastuussa olevaa proteiinia. Substraattina käytin kaupallista amorfista ATP:tä. Tämän työn aikana Sigma ilmoitti erittäin puhtaasta ATP:n kiteisestä johdannaisesta, jonka he olivat juuri valmistaneet. Onnistuin saamaan osan tätä ainetta, enkä yllätyksekseni enää havainnut vaihtoreaktiota kiteisen johdannaisen kanssa osittain puhdistamani proteiinifraktion läsnä ollessa. Tämä tosiasia kuitenkin ilahdutti Severo Ochoaa ja minua, sillä toivoimme amorfisen valmisteen sisältävän mielenkiintoisen kofaktorin. Päätin eristää osan amorfisesta valmisteesta, joka kiteiseen ATP:hen lisättynä käynnisti aineenvaihdunnan uudelleen. Mikä oli yllätykseni, kun kromatografia tunnisti tämän aineen ADP:ksi. Itse asiassa ATP oli vain leimattu, koska adenylaattikinaasi edelleen kontaminoi proteiinifraktiota (tiedetään, että adenylaattikinaasin jäämistä on erittäin vaikea päästä eroon). Pidin tämän mielessäni, kun kerroin ryhmälle lounaalla tästä löydöstä. Kukaan ei uskonut minua, ja Severo Ochoa löi minua sanoen, että se oli mahdotonta, mutta sitten hän katui tätä, ja laboratorioon tullessaan pystyin helposti vakuuttamaan hänet, että todellinen substraatti vaihtoreaktiossa oli ADP. . Hän oli järkyttynyt, koska kukaan ei tiennyt entsyymistä, joka kykenisi katalysoimaan tällaista vaihtoa, ja hyväksyi yritykseni yrittää ymmärtää, mikä oli syynä siihen tässä reaktiossa. Huomasin pian, että tämä entsyymi ei ole spesifinen ADP:lle, vaan katalysoi vaihtoa muiden difosfaattinukleotidien (UDP, CDP, GDP ja IDP) kanssa.

Kesällä 1954 Severo Ochoasta tuli biokemian tiedekunnan dekaani ja hän muutti uuteen rakennukseen kadun toisella puolella. Tilaa oli enemmän, kellarissa oli koetehdas, jota johtivat Morton Schneider ja Peter Lozina; siellä oli myös mukavampaa työskennellä radioaktiivisten isotooppien kanssa. Seymour Kaufman, Joe Stern ja Alice del Campillo jättivät ryhmän, kun taas Bill Jacobi, Martin Flavin ja Charles Gilward jäivät; uusia työntekijöitä olivat Gegard Plaut ja Enrico Cutolo. Täällä meillä oli enemmän tiloja lounaalle, ja meillä vieraili enemmän ihmisiä. On aika entistä aktiivisemmille ja iloisemmille hetkille. Mutta uuden reaktion löytämisen ensimmäisen jännityksen jälkeen vietin useita pettymyskuukausia yrittäessäni edistyä. Tänä aikana Severo Ochoa antoi minulle koko sydämestäni tukea ja rohkaisua pyrkimyksissäni puhdistaa entsyymiä edelleen. Tein tämän, mutta en silti pystynyt tunnistamaan reaktiota: se oli kuin sinulla olisi proteiinikide, mutta et tunnista itse kiteytyvää proteiinia. Vaihdon aikana vapautui jonkin verran fosfaattia, mutta tämä johtui fosfataasikontaminaation jäännöksestä. Severo Ochoa alkoi masentua, että Pinchot oli tuolloin eristänyt Alcaligenes faecalisista erilaisia ​​fraktioita, jotka sekoitettuna katalysoivat puhtaiden fosfaattiryhmien ottoa, jota seurasi elektronien siirto. Hän alkoi kyseenalaistaa vaihdon arvoa ja hyväksyi yritykseni luoda Pinchotin kokeilu Azotobacter vinelandi -uutteella. Muistin, että Pinchot vieraili meillä ja teki kokeita laboratoriossamme. En kuitenkaan ollut valmis ratkaisemaan ongelmaa välittömästi. Erityisesti minua hämmästytti pieni fosfaatin vapautuminen, vaikka tiesin varmasti, että entsyymi oli hyvin puhdistettu fosfataasista, ja päätin jäljittää tämän ilmiön syyn.

Tällä hetkellä Severo Ochoa meni Eurooppaan (mielestäni kansainväliseen biokemian liittoon liittyvässä liiketoiminnassa). Lupasin hänelle, että jos minulla ei ole tuloksia ennen hänen paluutaan, alkaisin jälleen etsiä pientä PO4:ää Azotobacter vinelandi -uutteista. Tein yksinkertaisen kokeen, joka oli ratkaiseva polynukleotidifosforylaasin löytämisessä: korvasin ADP:n inosiinidifosfaatilla (IDP). Adenylaattikinaasi on inaktiivinen inosiinijohdannaisia ​​kohtaan, joten vältin adenylaattikinaasin muodostamien mono- ja trijohdannaisten monimutkaisuudet ja piirsin kyllästymiskäyrän. Difosfaatteja oli vaikea saada ja kalliita, ja minun täytyi perustella niiden käyttäminen triviaalilta kokeelta. Kuitenkin tyydyttyneessä tilassa (polynukleotidifosforylaasilla on alhainen affiniteetti difosfaattijohdannaisiin) havaitsin merkittävän fosfaattiryhmien vapautumisen. Oli lohtua tajuta, että minulla ei ollut vain vaihtoreaktio, vaan myös reaktio, joka tuottaa PO4:a. Aloin heti tunnistaa kromatografisesti toista reaktiotuotetta. Tältä puolelta difosfaatin hydrolyysin reaktio monofosfaatiksi on edelleen kiinnostava. Samaan aikaan Gegard Plaut työskenteli tiedekunnassa tutkien IDP-aasia, jonka hän eristi rotan maksan mitokondrioista, mutta minun tapauksessani reaktio näytti palautuvalta ja hydrolyyttisten reaktioiden palautuvuus näytti epätodennäköiseltä. Reaktioseoksen kromatografia Dowess-kolonnilla osoitti IMP:n muodostumista, mikä miellytti minua, mutta aluksi en pystynyt tunnistamaan uusia tuotteita kolonnin eluaatista. Tämän perusteella syntetisoitu entsyymi saattoi olla yhdiste, joka ei eluoitunut tämän kokeen olosuhteissa. Aloin toivoa, en täysin uskonut tähän, että kolonniin laskeutunut tuote voisi olla korkean molekyylipainon omaava yhdiste. Onneksi kromatografiapaperia käyttäen pystyin tunnistamaan reaktioseoksesta entsymaattisen inkubaation jälkeen tuoreen ultraviolettivalon täplän, joka ei tullut kromatogrammin alusta, ja tajusin, että tuloksena oleva entsyymi oli polynukleotidi. En koskaan unohda päivää, jolloin näin uuden paikan - olin niin tunteiden vallassa, että halusin kertoa tapahtumasta kaikille laboratoriossa oleville, mutta pettymykseksi, kuten Severo Ochoan tapauksessa kondensoivalla entsyymillä , siellä ei ollut ketään - Se oli loma. Lopulta soitin Severolle kotiin; hän oli hämmästynyt tapahtuneesta. Hän oli tietysti iloinen löydöstä, mutta syvällä sisimmässään hän silti toivoi, että syntetisoidussa tuotteessa oli pyrofosfaattisidos ja että se liittyi jotenkin oksidatiiviseen fosforylaatioon. Tämä osoittaa hyvin, kuinka kaukana molekyylibiologiasta olivat silloisten entsymologien edut. Nukleiinihappojen entsymologiaa tutkittiin sitten muualla pienissä ryhmissä, useimmiten englantilaisissa (Markham, Piri, Kalkar). En usko, että en koskaan kuullut sanaa "nukleiinihappo" ensimmäisenä vuonnani New Yorkissa. Mutta pian olimme järkyttyneitä löydöstä. Severo Ochoa kertoi minulle pitäessään P-entsyymiä käsittelevän seminaarin Bezesdassa, lopuksi hän mainitsi lyhyesti löydön (emme vielä ymmärtäneet polymeerin rakennetta) ja näki kuinka unelias koko seminaari Kalkar yhtäkkiä heräsi, hyppäsi tuoliinsa!

Leon Heppelin, Jacque Frescon ja Alex Richin avulla tulokset tulivat nopeasti. Pystyin osoittamaan, että tuote saostui hapolla (tämä oli toinen hämmästyttävä hetki: näin kuinka polymeeri muodosti kiinteän geelin; luulen, että Jacques Fresco oli tuolloin paikalla) ja huomasin, että polymeerillä oli korkea molekyylipaino, mikä määritti ensin Alex Rich. Pian huomasin, että polymeerissä oli kaksi esteriryhmää. Leon Heppelillä oli käytössään kaikki aineen rakenteen tutkimiseen tarvittavat entsyymit, ja tavanomaisella anteliaasti hän antoi meille kaiken mitä tarvitsimme [26] . Adenosiinin, uridiinin, sytosiinin ja guanosiinidifosfaattien seosta käyttämällä pystyin syntetisoimaan RNA:n kaltaisen kopolymeerin, joka sisälsi neljä emästä [27] .

Keskustelimme entsyymin nimestä. Severo Ochoa toivoi, että se voisi olla in vivo osallisena jonkinlaisessa (ehkä alukkeen läsnä ollessa) polynukleotidisynteesissä, ja oli taipuvainen kutsumaan sitä RNA-syntetaasiksi. Minä puolestaan ​​uskoin, että entsyymi osallistuu RNA:n hajoamiseen, ja uskoin, että olisi oikeampaa kutsua sitä fosforylaasiksi. Lopulta Severo sanoi minulle: "Marianne, koska rakastan sinua erittäin paljon, hyväksyn nimesi."

Esittelin työn kokeellisen biologian yhdistysten liiton kokouksessa San Franciscossa vuonna 1955. Muistan, että sali oli ennen puhettani melko tyhjä ja täynnä aivan hänen edessään (huhu avajaisista oli jo levinnyt). Työ herätti huomattavaa kiinnostusta: se oli ensimmäinen tapaus, jossa solunulkoinen synteesi tapahtui RNA:n kaltaisesta makromolekyylistä ainetta. Polynukleotidifosforylaasin löytäminen antoi suuren sysäyksen biokemistien tutkimukselle kaikkialla maailmassa: pakotin heidät tutkimaan väliaineenvaihdunnan ja oksidatiivisen fosforylaation lisäksi myös muita prosesseja. Tämä inspiroi heitä tutkimaan entsyymejä, kuten RNA- ja DNA-polymeraaseja, jotka ovat vastuussa nukleiinihappojen synteesistä. Biokemistit kiinnostuivat proteiinien ja nukleiinihappojen synteesistä. Tämän ansiosta Paul Dotyn, Alex Richin, Jacque Frescon ja Gary Felsenfeldin laboratoriot pystyivät tutkimaan DNA:n ja RNA:n rakennetta. Entsyymien alhaisen spesifisyyden vuoksi niillä voitiin syntetisoida erilaisia ​​polymeerejä, mikä johti synteesitekniikan modernisointiin Doty-laboratoriossa. Löytämiseni aikaan Watson ja Crick selvittivät DNA:n rakenteen, mutta ehkä sen vahvin merkitys oli sen käyttö geneettisen vuoden tulkinnassa (katso alla). Biokemisteille on tullut uusi aika - molekyylibiologian muodostumisen aika. Löytö palkittiin lääketieteen Nobel-palkinnolla vuonna 1959 [28] . Palkinto jaettiin Arthur Kornbergin kanssa hänen DNA-polymeraasityöstään. Severo Ochoa tarjosi minulle työtä ja neuvoi minua jäämään Yhdysvaltoihin, missä minulla oli enemmän mahdollisuuksia kuin Ranskassa, mainitsemalla urani esimerkkinä, mutta päätimme mieheni kanssa lopulta palata Ranskaan, varsinkin koska odotin tytärtä. .

Palattuani työskentelin entsyymin rakenteen ja roolin parissa in vivo . Se oli vaikeampaa kuin aluksi näytti. Nyt monien tutkijoiden tutkimusten perusteella on selvää, että se osallistuu mRNA:n hajoamiseen sekä poistaen lähetti-RNA:ta että tarjoamalla esiasteita RNA:n ja DNA:n synteesille. Olen kiitollinen Severo Ochoalle kokemuksesta, jonka sain työskennellessään hänen laboratoriossaan, sekä siinä vallitsevasta ilmapiiristä, jonka hän pystyi luomaan. Tähän asti minulla on monia ystäviä ja tuttuja tutkijoista hänen laboratoriosta, ja me kaikki tunnemme kuuluvamme Severo Ochoan perheeseen.

Muistiinpanot

  1. ↑ 1 2 Severo Ochoa // Encyclopædia Britannica 
  2. ↑ 1 2 Severo Ochoa // Brockhaus Encyclopedia  (saksa) / Hrsg.: Bibliographisches Institut & FA Brockhaus , Wissen Media Verlag
  3. ↑ 1 2 Severo Ochoa de Albornoz // Gran Enciclopèdia Catalana  (kat.) - Grup Enciclopèdia Catalana , 1968.
  4. ↑ https://sevilla.abc.es/sevilla/sevi-casi-siglos-formacion-cientifica-y-humanistica-instituto-san-isidoro-sevilla-201805130843_noticia.html
  5. ↑ Tietoja Nobel-komitean verkkosivuilta Arkistoitu 2. helmikuuta 2007 Wayback Machinessa 
  6. ↑ 1 2 Bigr. Mems Fell. R. Soc. vol. 43 351-365. (1997)
  7. ↑ MIKROMENETELMÄ LIHAKSEN KOKONAISKREATIININ ARVIOINTIIN
  8. ↑ (JG Valdecasasin kanssa) Mikromenetelmä kreatiniinin arvioimiseksi lihaksessa J. Biol Chem. 81, 351-357. (1929)
  9. ↑ (R.A. Petersin kanssa) B1-vitamiini ja karboksylaasi eläinkudoksissa. Biochem. J. 32, 1501-1515 (1938)
  10. ↑ (I. Bangan ja R.A. Petersin kanssa) Pyruvaattihapetus aivoissa. VII. Jotkut pyruvaatin hapetusjärjestelmän dialysoitavissa olevat komponentit. Biochem. J. 33, 1980-1996. (1939)
  11. ↑ Fosforylaation kytkentä pyruviinihapon ja aivojen hapettumiseen. J Biol Chem. 138, 751-773 (1941)
  12. ↑ Aerobisen fosforylaation tehokkuus soluttomissa uutteissa. J Biol Chem. 151, 493-505 (1943)
  13. ↑ Trikarboksyylihappojen biosynteesi hiilidioksidifiksaatiolla. III. Entsymaattiset mekanismit. J Biol Chem. 174, 133-157 (1948)
  14. ↑ (A. H. Mehlerin ja A. Kornbergin kanssa) Dikarboksyylihappojen biosynteesi hiilidioksidifiksaatiolla. I. I-omenahapon palautuvaa oksidatiivista dekarboksylaatiota katalysoivan entsyymin eristäminen ja ominaisuudet kyyhkyn maksasta. J Biol Chem. 174, 979-1000.
  15. ↑ (W. Vishniacin kanssa) Pyridiininukleotidien fotokemiallinen pelkistys pinaattigranalla ja kytketyllä hiilidioksidifiksaatiolla. Nature 167, 768-769 (1951)
  16. ↑ (JR Sternin ja MC Schneiderin kanssa) Sitruunahapon entsymaattinen synteesi. II. Kiteinen kondensoiva entsyymi. J Biol. Chem. 193, 691-702
  17. ↑ (JR Stern & E Lynenin kanssa) Sitruunahapon entsymaattinen synteesi. V. Asetyylikoentsyymin reaktio AJ Biol. Chem. 198, 313-321 (1952)
  18. ↑ (S. Korken ja A. del Campillon kanssa) Dikarboksyylihappojen biosynteesi hiilidioksidifiksaatiolla IV. Lactobacillus arabinosuksen mukautuvan omenaentsyymin eristäminen ja ominaisuudet. J Biol Chem. 187, 891-905. (1950)
  19. ↑ Stern, JR, Coon, MJ, del Campillo, A. & Schneider, MC 1956 Enzymes of fatty ecid metabolia. IV. Koentsyymi-a-transferaasin valmistus ja ominaisuudet. J Biol. Chem. 221, 15-31
  20. ↑ (M. Flavinin kanssa) Propionihapon aineenvaihdunta eläinkudoksissa. I. Propionaatin entsymaattinen muuntaminen sukkinaatiksi. J Biol. Chem. 229, 965-979 (1957)
  21. ↑ (M. Flavinin ja H. Castro-Mendozan kanssa) Propionihapon aineenvaihdunta eläinkudoksissa. II. Propionyylikoentsyymi A karboksylaatiojärjestelmä. J Biol. Chem. 229, 981-996
  22. ↑ (Y. Kaziron ja E. Leonen kanssa) Biotiini ja propionyylikarboksylaasi. Proc. Natn. Acad. sci. USA 46, 1319-1327. (1960)
  23. ↑ (S. Kaufmanin, C. Gilvargin ja O. Corin kanssa) A-ketoglutaraatin entsymaattinen hapetus ja parifosforylaatio. J Biol. Chem. 203, 869-888. (1953)
  24. ↑ Kaufman, S. Fosforyloivan entsyymin katalysoiman reaktion mekanismin tutkimukset. J Biol. Chem. 216, 153-164. (1955)
  25. ↑ 1 2 3 (IA Rosen, M. Grunberg-Managon ja SR Koreyn kanssa) Asetaatin entsymaattinen fosforylaatio. J Biol. Chem. 211, 737-756. (1954)
  26. ↑ 1 2 (M. Grunberg-Managon kanssa) Polynukleotidien entsymaattinen synteesi ja hajoaminen; fosforylaasipolynukleotidi. J. Am. Chem. soc. 77, 3165-3166. (1955)
  27. ↑ 1 2 (M. Grunberg-Managon ja PJ Ortizin kanssa) Polynukleotidien entsymaattinen synteesi. I. Azotobacter vinalandii -bakteerin polynukleotidifosforylaasi. biochim. Biophys. Acta 20, 269-285. (1956)
  28. ↑ 1 2 Nobel Lectures 1959. Tukholma, s. 146-164.
  29. ↑ (P. Lengyel & JF Speyer) Synteettiset polynukleotidit ja aminohappokoodi Proc. Natn. Acad. sci. USA 47, 1936-1942.
  30. ↑ Lengyel, P. 1962 Synteettisten polynukleotidien käyttö geneettisen koodin purkamisessa. Tohtorin väitöskirja. New Yorkin yliopisto. J Biol Chem. 216, 153-164.
  31. ↑ (M. Salasin, MA Smithin, WM Stanley Jr:n ja AJ Wahban kanssa) Geneettisen viestin lukemissuunta. J Biol Chem. 240, 3988-3995. (1965)
  32. ↑ (Maa Smithin, M. Salasin, WM Stanley Jr:n ja AJ Whaban kanssa) Geneettisen viestin lukusuunta. Proc. Natn. Acad.Sci. USA 55, 141-147
  33. ↑ (JA Lastin kanssa, WM Stanley Jr., M. Salas, MB Hille & AJ Wahba) Geneettisen viestin käännös, IV UAA ketjun lopetuskodonina. Proc. Natn. Acad. Sci USA 57, 1062-1067
  34. ↑ (WM Stanley Jr:n, M. Salasin ja AJ Wahban kanssa) Yleisen viestin käännös: Proteiinisynteesin käynnistämiseen osallistuvat tekijät. Proc. Natn. Acad. sci. USA 56, 290-295. (1966)
  35. ↑ (M. Salas, MB Hille, JA Last & AJ Wahba) Geneettisen koodin viestin käännös. II. Alkutekijöiden vaikutus formyylimetionyyli-tRNA:n sitoutumiseen ribosomeihin. Proc. Natn. Acad.Sci USA 57, 387-394. (1967)
  36. ↑ (K. Iawasakin, S. Sabon ja AJ Wahban kanssa) Geneettisen viestin käännös. VII. Aloitustekijöiden rooli ketjun aloituskompleksin muodostumisessa Escherichia colin ribosomien kanssa. Arch Biochem. Biophys. 125, 542-547. (1968)
  37. ↑ (M. Zasloffin kanssa) Polypeptidiketjun aloitus eukaryooteissa. IV. Supernatantin aloitustekijän puhdistus ja ominaisuudet Artemia salina -alkioista. J. Mol. Biol. 73, 65-76. (1973)
  38. ↑ (C. de Haron kanssa) Lisätutkimuksia hemin säätelemän translaation estäjän vaikutustavasta. Proc. Natn. Acad. Sci USA 76,1741-1745. (1979)
  39. ↑ (A. Dattan, C. de Haron ja JM Sierran kanssa) Hemiinin translaation säätelymekanismi retikulosyyttilysaateissa. Proc. Natn. Acad. Sci.USA 74, 3326-3329. (1977)
  40. ↑ Weismann, C. 1976 julkaisussa Reflections on biochemistry (toim. A. Kornberg, BL Horecker, L. Cornudella & J. Oro), s. 283-292. New York: Pergamon.
  41. ↑ Harrastuksen tavoittelu. L. Rev. Biochem., 491-530. (1980)

Linkit

  Siirry Wikidata-kohteeseen  Temaattiset sivustot
Sanakirjat ja tietosanakirjat
Sukututkimus ja nekropolis