DNA - agaroosigeelielektroforeesi on analyyttinen menetelmä, jota käytetään DNA -fragmenttien erottamiseen pituuden mukaan. Se perustuu eripituisten fragmenttien erilaiseen liikenteeseen, kun ne liikkuvat geelissä ulkoisen sähkökentän vaikutuksesta .
Yksi menetelmän sovelluksista on plasmidi - DNA:n tutkiminen. Se on yleensä rengasmainen ja muodostaa toissijaisia rakenteita, kuten kiertymisen superkelaksi . Siten plasmidin koon määrittämiseksi on välttämätöntä tuhota sekundaarirakenteen elementit. Tätä varten plasmidi "linearisoidaan" ennen geelille levittämistä (tehdään lineaariksi), eli sitä käsitellään jollakin restriktioentsyymeistä (endonukleaaseista). Restriktioentsyymi valitaan siten, että se katkaisee plasmidin vain yhdestä kohdasta.
Eripituisten DNA-fragmenttien erottamiseen käytetään geeliä, jossa on eri pitoisuudet agaroosia. Mitä lyhyempi erotettavat DNA-fragmentit ovat, sitä suurempi on agaroosin pitoisuus:
Erotettavien DNA-fragmenttien pituus , bp |
Agaroosipitoisuus , % |
|---|---|
| 50-1500 | 2 |
| 300-3000 | 1.5 |
| 400-6000 | 1.2 |
| 500-10 000 | yksi |
| 800-10 000 | 0.7 |
| 1000-20000 | 0.5 |
Elektroforeesin aikana DNA-fragmentit kulkeutuvat geelissä sähkökenttävoimien vaikutuksesta . Tosiasia on, että DNA-molekyylien sokeri-fosfaattirunko on negatiivisesti varautunut ja siksi DNA-ketjut siirtyvät negatiivisesti varautuneesta katodista positiiviselle anodille . Pidemmät molekyylit liikkuvat hitaammin pysyessään geelissä, lyhyemmät molekyylit liikkuvat nopeammin.
Ennen elektroforeesin aloittamista on tapana lisätä näytteisiin kahta erilaista väriainetta, joiden pH on hapan (ksyleenisinistä ja bromifenolisinistä käytetään usein tähän tarkoitukseen ) elektroforeesin etenemisen visualisoimiseksi ja näytteiden painottamiseksi glyserolilla (jopa 20 % glyserolia). näytteessä). Väriainetta tarvitaan myös sen määrittämiseksi, milloin prosessi lopetetaan.
Elektroforeesi suoritetaan puskuriliuoksella täytetyssä kammiossa . Yleisimmin käytetyt puskurit sisältävät EDTA :ta , Trisiä ja joko boori- tai etikkahappoa. Tämän mukaisesti boorihappoa sisältävää puskuria kutsutaan nimellä TBE (tris-borate-EDTA) ja etikkahappoa sisältävää puskuria kutsutaan nimellä TAE (tris-asetaatti-EDTA). TBE:n ja TAE:n emäliuosten pitoisuudet ovat 6x ja 50x, vastaavasti, verrattuna niiden käyttöpitoisuuksiin. Puskuria tarvitaan lisäämään liuoksen ionivahvuutta , jossa DNA-molekyylien erottuminen tapahtuu käytetyn sähkökentän vaikutuksesta.
Erottamisen jälkeen (joskus väriaine lisätään sulaan agaroosiin) eripituiset DNA-fragmentit visualisoidaan käyttämällä fluoresoivia väriaineita, jotka ovat spesifisesti vuorovaikutuksessa DNA:n kanssa, esimerkiksi agaroosigeelit värjätään yleensä etidiumbromidilla , joka interkaloituu dupleksin typpipitoisten emästen väliin. ja fluoresoi UV - säteissä.
Kokomääritys suoritetaan vertaamalla tunnetun pituisia kaupallisia DNA-fragmentteja ("DNA-tikkaat", "viivaimet", "DNA-merkit") ja DNA:ta testatuissa näytteissä. Yleensä yksittäisten fragmenttien sisältö ilmoitetaan myös kaupallisissa markkereissa, jotta vyöhykkeiden intensiteettiä vertailemalla voidaan nopeasti arvioida DNA-pitoisuus testatuissa näytteissä. Tarvittaessa DNA-markkereita geelille voidaan valmistaa itsenäisesti käsittelemällä plasmidia restriktioentsyymillä, joka leikkaa sen useista kohdista. Tätä varten valitaan endonukleaasi, jonka vaikutuksesta muodostuu 5-6 eripituista fragmenttia.
Yleensä DNA:n elektroforeettiseen analyysiin käytetään agaroosigeelejä , mutta jos erotettavat DNA-fragmentit ovat vain muutaman kymmenen emäsparin pituisia, voidaan käyttää polyakryyliamidigeeliä . Polyakryyliamidigeeliä käytetään myös korkearesoluutioisiin lyhyisiin DNA-molekyyleihin DNA- sekvensoinnissa .