DNA-komeetta menetelmä

Kokeneet kirjoittajat eivät ole vielä tarkistaneet sivun nykyistä versiota, ja se voi poiketa merkittävästi 22. elokuuta 2020 tarkistetusta versiosta . vahvistus vaatii 1 muokkauksen . DNA-komeettojen ulkonäkö ja järjestys:
Viisi ehdollista DNA-komeettatyyppiä, jotka otetaan huomioon analysoitaessa DNA-vaurion astetta

DNA-komeetta on menetelmä DNA-vaurioiden havaitsemiseksi ja korjauksen tutkimiseksi yksittäisten solujen tasolla. Menetelmällä voidaan havaita DNA-juosteen katkeaminen yksittäisissä soluissa. Se on nopea ja erittäin herkkä [1] .

Historia

Rydbergin ja Johansonin (1978) [2] työtä pidetään ensimmäisenä onnistuneena kokemuksena yksittäisten solujen DNA-vaurioiden tutkimisesta . Myöhemmin menetelmää muokattiin ja parannettiin toistuvasti sen yksinkertaistamiseksi ja solu-DNA:n vaurioiden havaitsemisen herkkyyden lisäämiseksi [2] .

Soveltuvuus

DNA - komeetta - menetelmää voidaan soveltaa sekä in vivo - että in vitro -järjestelmissä . Tällä hetkellä menetelmää käytetään laajalti ionisoivan säteilyn genotoksisuuden , lääkkeiden ja teollisuuskemikaalien, DNA:n korjauksen, apoptoosin, synnytystä edeltävän diagnoosin kliinisissä tutkimuksissa, syöpäalttiuden, syöpähoidon ja kaihien tutkimuksissa. Tästä menetelmästä on vähitellen tulossa olennainen osa biomonitorointiohjelmia:

ruokavalion, ympäristötekijöiden, aineenvaihdunnan ja fysiologisen tilan muutosten, elimistön ikääntymisen vaikutuksen arviointi DNA-vaurioiden kertymiseen ja korjaamiseen;
tutkia säteilyä suojaavien vaikutusten mekanismeja, radioadaptiivisen vasteen muodostumista;
ympäristötutkimus.

Menetelmän käyttö mahdollistaa monimutkaisten populaatioiden heterogeenisyyden huomioimisen, DNA-vaurion ja korjauksen tuoton tutkimisen lähes kaikissa eukaryoottisoluissa. Samanaikaisesti analyysiin tarvitaan vain muutama tuhat testinäytteen solua [1] [3] .

Selvitys menetelmästä

Tutkittavalle tekijälle altistettujen solujen immobilisointi suoritetaan matalassa lämpötilassa sulavassa agaroosissa, joka on kerrostettu lasilevylle mikroskopiaa varten. Näytteiden käsittely runsaasti suolaa sisältävässä puskurissa johtaa solukalvojen hajoamiseen ja proteiinien uuttamiseen. DNA-molekyylit erotetaan elektroforeesilla, DNA-jäljet visualisoidaan värjäämällä fluoresoivalla väriaineella, minkä jälkeen näytteet tutkitaan mikroskooppisesti. DNA-katkojen läsnä ollessa kromatiinin rakenteellinen organisoituminen häiriintyy ja DNA:n superkiertyminen menetetään , mikä johtaa tämän biomakromolekyylin rentoutumiseen ja muodostuu DNA-fragmentteja, jotka eivät liity soluun. Sähkökentässä relaksoituja silmukoita ja DNA-fragmentteja venytetään kohti anodia, mikä antaa havainnollisille kohteille "komeettojen" ulkonäön (siis nimi " comet assay ", joka on yleistynyt). Anodia kohti kulkeutuvan ja mikrofotometrillä määritettyä DNA:n määrää voidaan käyttää indikaattorina, joka kuvaa DNA-vaurion tasoa tutkituissa soluissa. "Komeetat" analysoidaan joko visuaalisella havainnolla ja "komeettojen" erottelulla DNA-vaurion asteen mukaan tai käyttämällä tietokoneen kuvankäsittelyohjelmistoa. Jälkimmäinen "komeettojen" analyysimenetelmä on erityisen tarpeellinen vahingollisen aineen pienen pitoisuuden vaikutuksen objektiiviseen arviointiin tai pienten erojen tunnistamiseen solualapopulaatioiden välillä [1] .

Menetelmän standardointi

Tällä hetkellä useimmat laboratoriot, jotka ovat soveltaneet tätä metodologista lähestymistapaa tutkimuksessa, ovat kehittäneet lukuisia muunnelmia protokollasta, erityisesti solujen hajoamisen, denaturaation, elektroforeesin ja DNA-värjäyksen keston ja olosuhteiden osalta. 25-500 solua lasketaan yhdelle lasille kahtena rinnakkaisena. Kokeen tulokset ovat luotettavia, kun se toistetaan vähintään 6 kertaa. DNA-komeettojen analyysi voidaan suorittaa visuaalisesti tai käyttämällä ohjelmisto- ja laitteistokompleksia. Visuaalisessa analyysissä DNA-komeetat luokitellaan viiteen ehdolliseen tyyppiin, joilla on vastaava numeerinen arvo välillä 0-4.

Indeksien laskeminen

Nimitys	Ominaista	Laskeminen
${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}$	DNA-komeetan indeksi (DNA-komeetan indeksi) ${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}$ - DNA-vaurion aste DNA-komeettojen indeksi lasketaan kunkin tyypin "DNA-komeettojen" summan suhteessa laskettujen "DNA-komeettojen" kokonaissummaan.	${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}={\frac {(0{\mbox{n}}_{0}+1{\mbox{n}}_{ 1}+2{\mbox{n}}_{2}+3{\mbox{n}}_{3}+4{\mbox{n}}_{4})}\Sigma }$ , missä on kunkin tyypin "DNA-komeettojen" lukumäärä ja ${\mbox{n}_0 - \mbox{n}_4}$ ${\Sigma}$ - laskettujen "DNA-komeettojen" summa.

Kuvantamis- ja analyysiohjelmat

CometScore on ilmainen ohjelma DNA-komeettapisteiden puoliautomaattiseen laskemiseen, ja se on yhteensopiva Windows 5:n ja 6:n kanssa.
CaspLab - GPL-ohjelmisto.
Kaupallinen ohjelma - Comet Assay Interest Groupin listaama

Katso myös

Muistiinpanot

↑ 1 2 3 Sorochinskaya, Mikhailenko, 2008 , s. 303-309.
↑ 1 2 Rydberg B, Johanson KJ. DNA-juosteen katkeamisen arviointi yksittäisissä nisäkässoluissa // Academic Press. - New York, 1978. - S. 465-468 .
↑ S. Cotelle ja JF Ferard. Comet Assay in Genetic Ecotoxicology: Review // Environmental and Molecular Mutagenesis. - Wiley-Liss, 1999. - T. 34 . - S.: 246-25 . Arkistoitu alkuperäisestä 4. maaliskuuta 2016.

Kirjallisuus

Pitkäaikaiseen altistumiseen haitallisille ympäristötekijöille liittyy DNA-vaurioiden kertymistä ja muutoksia korjausjärjestelmän toiminnassa, mikä voi johtaa mutaatioihin ja solun pahanlaatuiseen transformaatioon. Viime vuosina on kehitetty monia menetelmiä DNA-vaurioiden havaitsemiseen ja korjausprosessien tutkimiseen. Kaikilla niistä ei kuitenkaan ole riittävää herkkyyttä ja spesifisyyttä monien DNA:n ympäristövaurioiden seuraamiseen. Katsauksen tavoitteena on arvioida lyysattujen yksittäisten solujen geelielektroforeesimenetelmän (DNA-komeettamenetelmä) tehokkuutta erilaisten ympäristötekijöiden aiheuttamien DNA-vaurioiden havaitsemiseen. Menetelmällä on riittävä herkkyys DNA-vaurion havaitsemiseen ja korjaamiseen yksittäisen solun tasolla, ja sitä voidaan käyttää genomin integraalisen eheyden arvioimiseen.
W.B. Sorochinska, V.M. Mihailenko. DNA-komeettamenetelmän soveltaminen eri ympäristötekijöiden aiheuttamien DNA-vaurioiden arvioimiseen // ONCOLOGY : Artikkeli. - Kiova, 2008. - T. 10 , no. 3 . - S. 303-309 . Arkistoitu alkuperäisestä 5. maaliskuuta 2016. (Venäjän kieli)
Avishai, Nanthawan; Rabinowitz, Claudette; Moiseeva, Elisabeth & Rinkevich, Baruch. Kishon-joen genotoksisuus: in vitro -solutestin soveltaminen : HTML-tiivistelmä. - Israel: Mutation Research, 2002. - Vol. 1 , no. 518 . — S. 21–37 . - doi : 10.1016/S1383-5718(02)00069-4 .
Collins, A.R.; Dobson, VL; Dusinska, M.; Kennedy, G. & Stetina, R. The Comet Assay: mitä se voi todella kertoa meille? // Mutaatiotutkimus : HTML abstrakti. - 1997. - Osa 2 , numero. 375 . - S. 183-193 . - doi : 10.1016/S0027-5107(97)00013-4 .
Claude, M.; Erikson, S.; Nygren, J. & Ahnstrom, G. Comet assay: mekanismit ja tekniset näkökohdat. - Mutation Research, 1996. - Vol. 2 , no. 363 . - S. 89-96 . - doi : 10.1016/0921-8777(95)00063-1 .
McKelvey-Martin, Valerie J.; Ho, Edwin T.; McKeown, Stephanie R.; Johnston, S. Robin; McCarthy, Patsy J.; Rajab, Nor Fasilah & Downes, C. Stephen. Yksisolugeelielektroforeesi (Comet) -määrityksen uusia sovelluksia. I. Invasiivisen siirtymäsoluisen ihmisen virtsarakon karsinooman hoito. II. Fluoresoiva in situ -hybridisaatio Komeetat vaurioituneiden ja korjattujen DNA-sekvenssien tunnistamiseen yksittäisissä soluissa : PDF fulltext. - Mutagenesis, 1993. - T. 1 , no. 13 . - S. 1-8 . - doi : 10.1016/0921-8777(95)00063-1 .
Olive, P.L.; Wlodek, D. & Banath, JP DNA:n kaksoisjuostekatkot mitattuna yksittäisissä geelielektroforeesille altistetuissa soluissa // Cancer Research : PDF fulltext. - 1991. - T. 17 , no. 51 . - S. 4671-4676 .
Rojas, E.; Lopez, MC & Valverde, M. Yksisolugeelielektroforeesi: metodologia ja sovellukset // Journal of Chromatography B : HTML abstract. - 1999. - T. 722 (1-2) . - S. 225-254 . - doi : 10.1016/S0378-4347(98)00313-2 .
Singh, N.P.; McCoy, M.T.; Tice, RR & Schneider, EL Yksinkertainen tekniikka alhaisten DNA-vaurioiden kvantifiointiin yksittäisissä soluissa // Experimental Cell Research. - 1988. - T. 175 (1) . - S. 184-191 . - doi : 10.1016/0014-4827(88)90265-0 .