Elektroporaatio

Kokeneet kirjoittajat eivät ole vielä tarkistaneet sivun nykyistä versiota, ja se voi poiketa merkittävästi 27. tammikuuta 2022 tarkistetusta versiosta . tarkastukset vaativat 2 muokkausta .

Elektroporaatio on huokosten muodostumista kaksikerroksiseen lipidikalvoon sähkökentän vaikutuksesta. Tätä ilmiötä käytetään biotekniikassa makromolekyylien (yleensä DNA :n tai RNA:n ) viemiseen nisäkäs- , bakteeri- tai kasvisoluihin , ja sitä käytetään myös lääketieteessä ja teollisuudessa.

Sähkökentän vahvistuminen elektroporaation aikana

Elektroporaatioilmiö perustuu siihen, että kalvoilla on kyky keskittää sähkökenttä. Tehdään potentiaaliero U kahden tasaisen rinnakkaisen elektrodin välillä, jotka sijaitsevat etäisyydellä L, ja niiden välinen rako täytetään heikosti johtavalla elektrolyytillä. Sitten kentänvoimakkuus jakautuu tasaisesti koko niiden väliseen tilaan. Laitetaan nyt kennon keskelle kaksikerroksinen lipidikalvo, jonka resistanssi on niin suuri, että sitä voidaan pitää sähköä johtamattomana dielektrisenä. Silloin koko potentiaaliero U keskittyy kalvolle.

Sähkökentän vahvistus on ilmeisesti yhtä suuri kuin L/h ~ 10^6, jos valitsemme L ~ 1 cm, h ~ 5 nm. Näin ollen, sopusoinnussa kokeellisten tulosten kanssa, riittää, että elektrodeihin sovelletaan satojen millivolttien luokkaa olevaa potentiaalieroa kaksikerroksen elektroporaation indusoimiseksi. Jos elektrodien välissä on nyt halkaisijaltaan noin 10 mikronia olevia kennoja ja haluamme saada ne elektroporoitumaan, on käytettävä paljon suurempia jännitteitä. Itse asiassa kalvon suuren resistanssin vuoksi liuos kennossa on ekvipotentiaalinen eli ulkoinen kenttä on suojattu liikkuvilla ioneilla, jotka muodostavat kaksoissähkökerroksisia diffuuseja levyjä. Siten kennon jännitteen hyppy on 2UR/L, joka keskittyy kalvolle kennon kahden navan alueelle. Jos hyväksymme sen, että tarvitaan esimerkiksi 0,5 V, niin elektrodeihin on kohdistettava U ~ L / R * 0,5 V. Näin ollen kun L ~ 1 cm, R ~ 5∙10^-4 cm, saadaan U ~ (1∙0.5)/(5∙10^(-4)) ~ 1 kV. Siksi solususpensioilla ja liposomeilla tehdyissä kokeissa on käytettävä erityisiä elektroporaattoreita, jotka pystyvät tuottamaan lyhyitä pulsseja, joiden amplitudi on jopa 1–10 kV.

Kun solususpensioon kohdistetaan sähkökenttäpulsseja, joiden voimakkuus on useista sadaista useisiin tuhansiin voltteihin/cm ja kestoltaan kymmenistä mikrosekunneista kymmeniin millisekunteihin, on mahdollista saada aikaan voimakas lisäys solukalvojen johtavuudessa. Kohtalaisen sähkökäsittelyn jälkeen solun johtavuus laskee normaaleihin arvoihin muutamassa sekunnissa - useissa minuuteissa. Voimakkaampi sähkökäsittely johtaa joidenkin solujen peruuttamattomaan tuhoutumiseen.

Soluilla suoritetuissa kokeissa on vaikea hallita suoraan solukalvoon syötettyä jännitettä. Lisäksi solukalvo on erittäin monimutkainen järjestelmä. Kalvon tärkeimmät estetoiminnot suorittaa fosfolipidikaksoiskerros, joka on läpäissyt proteiineja, jotka toimivat selektiivisinä kanavina tai aktiivisina pumppuina ioneille ja metaboliitteille. Mahdollisia syitä sähkönjohtavuuden kasvuun voivat olla muutokset sekä lipidikaksoiskerroksessa että proteiineissa. Kokeet keinotekoisella kaksikerroksisella lipidikalvolla (BLM) osoittivat sen sähköisen hajoamisen mahdollisuuden jännitteillä, jotka ovat lähellä niitä, joilla hajoaminen havaitaan solukalvossa. On osoitettu, että tietyn koostumuksen BLM:n sähköinen hajoaminen voi olla palautuva. Tämä osoittaa, että lipidikomponentin hajoaminen on vastuussa solujen läpäisevyyden lisääntymisestä. BLM:llä tehdyt kokeet osoittivat, että sähköinen rikkoutuminen tapahtuu stokastisesti ja kalvon keskimääräinen käyttöikä riippuu epälineaarisesti jännitteestä. Nämä havainnot johtivat teorian kehittämiseen nestemäisten lipidikaksoiskerrosten huokosten muodostumisesta ja kehittymisestä sähkökentässä. 1990-luvun lopulla kalvonjohtavuuden erittäin tarkkoja mittauksia käyttämällä oli mahdollista rekisteröidä yksittäisten elektrohuokosten esiintyminen BLM:ssä. Niiden keskimääräinen halkaisija on noin 0,5 nm. Solukalvoissa ne havaittiin elektronimikroskopialla.

Membraanielektroporaation teoria

BLM-elektroporaation teoria viittaa siihen, että kaksikerroksisessa lipidikalvossa tapahtuu paikallinen rakenteen uudelleenjärjestely, mikä johtaa läpivirtaavan vesikanavan ilmaantumiseen. Kaksi perushuokoskonfiguraatiota on mahdollista, hydrofiilinen ja hydrofobinen. Hydrofobisessa huokosessa huokosten seinämät on vuorattu lipidipyrstöillä, kun taas hydrofiilisissä huokosissa ne on vuorattu fosfolipidipäillä. Pienillä säteillä hydrofobinen huokos on energeettisesti edullinen ja suurilla säteillä hydrofiilinen huokos. Vedellä on korkeampi dielektrisyysvakio kuin lipideillä. Siksi huokosia sisältävällä kalvolla on vähemmän energiaa ulkoisessa sähkökentässä. Tämä energianlisäys on verrannollinen huokosten pinta-alaan ja neliöllinen sen säteellä. Huokossäteellä r* hydrofobisten ja hydrofiilisten huokosten energiat ovat yhtä suuret. Energiakäyrällä on paikallinen minimi, joka vastaa kaksoiskerroksen metastabiilia johtavaa tilaa, josta se tietyllä taajuudella siirtyy järjestelmän alhaisella johtavuudella olevaan häiriöttömään alkutilaan tai katkaisee. Hydrofiilisten huokosten muodostumisnopeutta yksikköpinta-alan (Kc) lipidikaksoiskerroksessa voidaan kuvata yhtälöllä $Kc=Aexp(\alpha U^{2})$

missä

$A=\nu /aexp(-\Delta W^{0}/kT)$ , $\alpha =\pi r_{*}^{2}(\epsilon _{w}-\epsilon _{m})\epsilon _{0}/(2dkT)$

Tässä a on pinta-ala yhtä lipidimolekyyliä kohden, d on kaksoiskerroksen paksuus, on tyhjiön dielektrisyysvakio, on kaksoiskerroksen dielektrinen permittiivisyys, on veden permittiivisyys, k on Boltzmannin vakio, on sivuttaisvaihteluiden taajuus. lipidimolekyylit, on siirtymätilaa vastaava huokossäde, T on lämpötila, U on sähköjännite kaksoiskerroksen poikki, on huokosen aktivaatioenergia sähkökentän puuttuessa. $\epsilon _{0}$ ${\displaystyle \epsilon _{m))$ $\epsilon_{w}$ $\nu$ $r_{*}$ $\Delta W^{0}$

Oletetaan, että huokosten ylikasvunopeus ei riipu käytetystä sähkökentästä ja kaksoiskerroksen huokostiheydestä.

Makromolekyylien toimittaminen soluihin elektroporaatiolla

Yllä kuvatut kokeet rajoittuivat itse asiassa pienten ionien huokosten läpi kuljettaman sähkövirran mittaamiseen. Samalla todettiin, että sähkökäsittely edistää makromolekyylien siirtymistä kalvojen läpi, joiden koko ylittää elektrohuokosten halkaisijan. Lisäksi elektroporaation ja suurten molekyylien kuljetuksen välillä on havaittu korrelaatio. Tieteellisissä töissä DNA-molekyylien kuljetuksen esimerkissä on todistettu, että ne pystyvät laajentamaan huokosia, jotka sitten hitaasti (~ 100 sek.) rentoutuvat alkuperäiseen tilaansa. Lisäksi suorat kokeet siellä osoittivat myös, että DNA-elektroforeesilla on tärkeä rooli ei vain näiden molekyylien soluun siirtymisvaiheessa, vaan myös kalvon läpi kulkeessaan. Sähkökenttä kirjaimellisesti puristaa plasmidi-DNA:n pieneen huokoseen samalla laajentaen sitä. Voimme sanoa, että plasmidi-DNA-molekyylit itse näyttelevät kultaisia mikroskooppisia luoteja, joita käytetään "geenipyssy" -menetelmässä. Vain käyttövoimat ovat luonteeltaan erilaisia - ensimmäisessä tapauksessa sähköisiä, toisessa mekaanisia. Toinen tärkeä tieteellisissä töissä toteutettu innovaatio on 2-pulssisen sähköisen prosessointitekniikan käyttö, joka mahdollisti kahden kenttäfunktion erottamisen ajallisesti - elektroporaation ja elektroforeesin. Ensimmäinen impulssi oli voimakas mutta lyhyt; sitten seurasi vaihtelevan keston aikaväli ja lopulta heikko vakiokenttä kytkettiin päälle. DNA:n lisääminen ennen ensimmäistä pulssia johti korkeaan transfektioon ja suurten dekstraanimolekyylien siirtymiseen, kun taas DNA:n lisäämisellä pulssien välisen ajanjakson aikana ei ollut juuri mitään vaikutusta.

Viime vuosikymmenen aikana elektroporaatiota on käytetty lääkkeiden transdermaaliseen siirtämiseen ihmiskehoon. Elektroporaatio on perusta useille transdermaalisille siirtotekniikoille, joita kutsutaan vesiforeesiksi , ei-invasiiviseksi mesoterapiaksi , neulattomaksi mesoterapiaksi tai injektiovapaaksi mesoterapiaksi.

Lääketieteelliset sovellukset

Elektroporaatiomenetelmää käytetään onkologisten sairauksien hoidossa: kasvaimen peruuttamaton elektroporaatio johtaa sen solujen paikalliseen tuhoutumiseen, mikrosekunnin 2000-3000 voltin sähköimpulssit kasvainsolujen kalvoissa muodostavat mikrohuokosia, mikä johtaa solujen homeostaasin häiriintymiseen. ja solukuolema [1] .

Teolliset sovellukset

Tuotteiden elektroporaatioon tarkoitettuja teollisuuslaitoksia (tekniikkaa kutsutaan PEF-pulssisähkökentällä) käytetään yhtenä tuotantoprosessin vaiheista: mehujen ja smoothieiden valmistuksessa pastörointia tai ultrapastörointia lempeämpänä desinfiointimenetelmänä , ja pakaste- ja kuivattujen tuotteiden valmistuksessa - tuotteiden paremman aistinvaraisten ominaisuuksien säilymiseen, veden kulutuksen ja tuotantohäviöiden vähentämiseen. Maailman johtava elintarviketuotannon teknologian toteuttaja on saksalainen Elea GmbH [2] .

Muistiinpanot

↑ Pelastus potilaalle, jolla oli leikkauskelvoton haiman adenokarsinooma, oli palautumattoman elektroporaation menetelmä . www.ronc.ru _ Kansallinen onkologian tutkimuskeskus, joka on nimetty N.N. N. N. Blokhin (21. tammikuuta 2022). Haettu: 27.1.2022. (Venäjän kieli)
↑ Elea GmbH . www.potatopro.com . Haettu: 18.1.2022.

Linkit

Kinosita, K., Jr. ja T.Y. Tsong. 1977. Valvotun kokoisten huokosten muodostuminen ja sulkeminen ihmisen punasolukalvossa. Nature 268:438-441.
Weaver, JC ja Y. Chizmadzhev. 1996. Elektroporaation teoria: Katsaus. Bioelectroch Bioener 41:135-160.
Zimmermann, U., G. Pilwat ja F. Riemann. 1974. Solukalvojen dielektrinen hajoaminen. Biophys J 14:881-899.
Abidor, IG, VB Arakelian, VF Pastushenko, MR Tarasevich ja LV Chernomordik. 1978. Lipidikaksoiskerroskalvojen sähköinen hajoaminen. Dokl Akad Nauk SSSR 240:733-736. (Abidor I. G., Arakelyan V. B., Pastushenko V. F., Tarasevich M. R. ja Chernomordik L. V. 1978. Lipidikaksikerroksisen kalvon sähköinen hajoaminen. Neuvostoliiton tiedeakatemian raportit 240: 733-736)
Glaser, RW, SL Leikin, LV Chernomordik, VF Pastushenko ja AI Sokirko. 1988. Lipidikaksoiskerrosten palautuva sähköinen hajoaminen - huokosten muodostuminen ja kehitys. Biochimica et Biophysica Acta 940:275-287.
Melikov, KC, VA Frolov, A. Shcherbakov, AV Samsonov, YA Chizmadzhev ja LV Chernomordik. 2001. Jännitteen aiheuttamat ei-johtavat esihuokoset ja metastabiilit yksittäiset huokoset modifioimattomassa tasomaisessa lipidikaksoiskerroksessa. Biophys J 80:1829-1836.
Chang, DC ja T.S. Reese. 1990. Elektroporaation indusoimat muutokset kalvon rakenteessa, jotka paljastettiin nopeasti jäädyttävällä elektronimikroskopialla. Biophys J 58:1-12.
Weaver, JC 1993. Elektroporaatio on yleinen ilmiö solujen ja kudosten käsittelyssä. J Cell Biochem 51:426-435.
Klenchin, VA, SI Sukharev, SM Serov, LV Chernomordik ja YA Chizmadzhev. 1991. Solujen sähköisesti indusoima DNA:n otto on nopea prosessi, johon liittyy DNA-elektroforeesi. Biophys J 60:804-811.
Sukharev, SI, VA Klenchin, SM Serov, LV Chernomordik ja YA Chizmadzhev. 1992. Elektroporaatio ja elektroforeettinen DNA:n siirto soluihin - DNA:n vuorovaikutuksen vaikutus elektrohuokosten kanssa. Biophys J 63:1320-1327.
Bezugly A.P., 2008. Aquaphoresis - ei-invasiivisen mesoterapian mahdollisuudet. "Nouvelle Estertic" nro 6:170-179.