| TEV-proteaasi | |
|---|---|
| Tunnisteet | |
| Koodi KF | 3.4.22.44 |
| CAS-numero | 139946-51-3 |
| Entsyymitietokannat | |
| IntEnz | IntEnz-näkymä |
| BRENDA | BRENDA sisääntulo |
| ExPASy | NiceZyme-näkymä |
| MetaCyc | metabolinen reitti |
| KEGG | KEGG-merkintä |
| PRIAM | profiili |
| ATE:n rakenteet | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum |
| Hae | |
| PMC | artikkeleita |
| PubMed | artikkeleita |
| NCBI | NCBI-proteiinit |
| CAS | 139946-51-3 |
| Mediatiedostot Wikimedia Commonsissa | |
TEV-proteaasi ( englanninkielisestä Tobacco Etch Virus -tupakkakaiverrusvirus ) on tupakan kaiverrusviruksen erittäin spesifinen kysteiiniproteaasi . Kuuluu kymotrypsiinin kaltaisten proteaasien PA- superperheeseen . Korkean sekvenssispesifisyytensä vuoksi sitä käytetään usein fuusioproteiinien kontrolloituun pilkkomiseen in vitro ja in vivo . [yksi]
Koko tupakkaetch-viruksen genomi koodaa yhtä massiivista polyproteiinia (350 kDa), joka pilkkoutuu toiminnallisiksi lohkoiksi kolmen proteaasin toimesta: P1-proteaasi (1 pilkkoutumiskohta), HC-Pro (1 pilkkoutumiskohta) ja TEV-proteaasi (7 katkaisukohtaa) . [2] Natiivi proteaasi sisältää myös sisäisen itsekatkaisukohdan. Tämä kohta lohkeaa hitaasti entsyymin inaktivoimiseksi (fysiologista syytä tähän ei tunneta).
TEV-proteaasin rakenne on määritetty käyttämällä röntgenkristallografiaa . [3] Entsyymi koostuu kahdesta β-sylinteristä ja joustavasta C-päästä, joka osoittaa rakenteellista homologiaa trypsiiniproteinaasien superperheen kanssa (PA-klaani, C4-perhe MEROPS-luokituksen mukaan). [4] Huolimatta homologiasta seriiniproteaasien (kuten trypsiini , elastaasi, trombiini jne.) kanssa, TEV-proteaasi käyttää kysteiiniä katalyyttisenä kohdanna [5] (kuten monet muutkin virusproteaasit).
Kovalenttinen katalyysi tapahtuu Asp-His-Cys-triadin kautta, joka on jaettu kahden p-sylinterin välillä (Asp on β1:ssä ja His ja Cys ovat β2:ssa). [6] Substraattia pidetään β-levyssä, mikä muodostaa vastasuuntaisen vuorovaikutuksen kahden sylinterin välisen uran kanssa ja rinnakkaisen vuorovaikutuksen C-pään kanssa. [7] Siten entsyymi muodostaa sitoutumistunnelin substraatin ympärille, ja sivuketjujen vuorovaikutukset tarjoavat spesifisyyttä. [3]
Luonnollinen katkaisusekvenssi määritettiin ensin tutkimalla katkaisukohdat natiivissa polyproteiinisubstraatissa toistuvan sekvenssin osalta. Natiivin katkaisukohdan konsensussekvenssi on ENLYFQ\S (jossa "\" tarkoittaa pilkkoutuvaa peptidisidosta). [8] Substraatin aminohappotähteet on numeroitu P6:sta P1:een ennen katkaisukohtaa ja P1':een leikkauksen jälkeen. Varhaisessa työssä arvioitiin myös samankaltaisten substraattien joukon pilkkoutumista määrittääkseen, kuinka spesifisesti entsyymi katkaisee natiivisekvenssin. [9] [10]
Myöhemmin tutkimuksissa käytettiin katkaistavien substraattien sekvensointia satunnaistettujen sekvenssien poolista edullisien kuvioiden määrittämiseksi. [11] [12] Vaikka ENLYFQ\S on optimaalinen sekvenssi, proteaasi on enemmän tai vähemmän aktiivinen eri substraateilla (eli siinä on jonkin verran vaihtelua). Tehokkain pilkkoutuminen tapahtuu sekvensseissä, jotka ovat eniten samankaltaisia kuin EXLYΦQ\φ-konsensus, jossa X on mikä tahansa aminohappotähde, Φ on mikä tahansa suuri tai keskikokoinen hydrofobinen tähde ja φ on mikä tahansa pieni hydrofobinen tai polaarinen aminohappotähde.
Spesifisyys saadaan aikaan suurella kontaktialueella entsyymin ja substraatin välillä. Proteaasit, kuten trypsiini , ovat spesifisiä yhdelle aminohappotähteelle ennen katkaistavaa sidosta ja sen jälkeen matalalla sitoutumisraolla, jossa on vain yksi tai kaksi taskua, jotka sitovat substraatin sivuketjuja. Sitä vastoin virusproteaaseilla, kuten TEV-proteaasilla, on pitkä C-terminaalinen häntä, joka sulkee substraatin kokonaan sisään sitomistunnelin luomiseksi. Tämä tunneli sisältää joukon sitoutumistaskuja siten, että peptidisubstraatin jokainen sivuketju (P6 - P1') sitoutuu komplementaariseen kohtaan (C6 - C1'). [3]
Erityisesti P6-Glu:n peptidisivuketju koskettaa kolmen vetysidoksen verkostoa; P5-Asn viittaa liuottimeen luomatta erityisiä vuorovaikutuksia (tästä syystä ei ole yksimielisyyttä substraatin sekvenssistä tässä paikassa); P4-Leu uppoaa hydrofobiseen taskuun; P3-Tyr pidetään hydrofobisessa taskussa, jonka päässä on lyhyt vetysidos; P2-Phe:tä ympäröivät myös hydrofobiset tähteet, mukaan lukien histidiinitriadin pinta; P1-Gln muodostaa neljä vetysidosta; ja P1'-Ser on vain osittain suljettuna matalaan hydrofobiseen uraan. [3]
Yksi tämän entsyymin tärkeimmistä käyttötavoista on affiniteettimerkkien poistaminen puhdistetuista fuusioproteiinivalmisteista . Syy TEV-proteaasin käyttöön biokemiallisena työkaluna on sen korkea sekvenssispesifisyys. Tämä tekee siitä suhteellisen myrkyttömän in vivo , koska sen tunnistamaa sekvenssiä ei melkein koskaan löydy proteiineista. [13]
Vaikka rationaalisella suunnittelulla on ollut rajallinen menestys proteaasin spesifisyyden muuttamisessa, suunnattua evoluutiota on käytetty edullisen tähteen muuttamiseksi ennen [14] tai [15] [16] katkaisukohtaa.
TEV-proteaasin käytössä on rajoituksia. Se on taipuvainen deaktivoitumaan itsestään pilkkoutumalla, vaikka tämä voidaan välttää mutaatiolla S219V sisäisessä pilkkoutumiskohdassa [17] . Yksin ilmennetty proteaasi on huonosti liukoinen; Sen liukoisuutta on yritetty parantaa ohjatun evoluution ja tietokonesimulaatioiden avulla. Lisäksi on osoitettu, että ilmentymistä voidaan parantaa fuusioimalla maltoosia sitovan proteiinin kanssa, mikä lisää kumppanin liukoisuutta.
Tämän entsyymin molekyylipaino vaihtelee välillä 25 - 27 kDa riippuen käytetystä konstruktista.