Nukleiinihappojen kvantitatiivinen analyysi

Kokeneet kirjoittajat eivät ole vielä tarkistaneet sivun nykyistä versiota, ja se voi poiketa merkittävästi 22. lokakuuta 2017 tarkistetusta versiosta . tarkastukset vaativat 9 muokkausta .

Nukleiinihappojen kvantitatiivinen analyysi  - DNA :n tai RNA :n pitoisuuden määrittäminen seoksessa tai puhtaassa valmisteessa. Nukleiinihappoja sisältävät reaktiot vaativat usein tarkkoja tietoja lääkkeen määrästä ja puhtaudesta. Liuoksen nukleiinihapon pitoisuuden määrittämiseen käytetään spektrofotometristä menetelmää ja UV-fluoresenssia, jos nukleiinihappo sisältää väriainetta.

Spektrofotometrinen analyysi

Nukleiinihapot absorboivat ultraviolettivaloa tietyllä tavalla . Spektrofotometreissä näyte altistetaan ultraviolettivalolle aallonpituudella 260 nm, ja fotodetektori mittaa näytteen läpi kulkeneen valon määrän. Mitä enemmän valoa absorboituu, sitä suurempi on nukleiinihapon pitoisuus näytteessä.

Bouguer-Lambert-Beer-lakia käyttämällä on mahdollista korreloida säteilyä absorboivien molekyylien pitoisuus absorboituneen valon määrään. Aallonpituudella 260 nm kaksijuosteisen DNA:n keskimääräinen ekstinktiokerroin on 0,020 (μg/ml) −1 cm −1 , yksijuosteiselle DNA:lle 0,027 (μg/mL) −1 cm −1 RNA 0,025 (μg/mL) -1 cm -1 ja lyhyiden yksijuosteisten oligonukleotidien ekstinktiokerroin riippuu typpipitoisten emästen pituudesta ja suhteesta (noin 0,030 (μg/mL) -1 cm -1 ). Näin ollen optinen tiheys ( eng.  OD, optinen tiheys ), joka on yhtä suuri kuin 1, vastaa kaksijuosteisen DNA:n pitoisuutta noin 50 ug/ml. Spektrofotometristä menetelmää nukleiinihappojen pitoisuuden määrittämiseen käytetään pitoisuuksilla 2 OD asti. [1] Oligonukleotidien pitoisuuden määrittämiseen tarvitaan tarkempia ekstinktiokertoimia, ja ne voidaan ennustaa käyttämällä lähimmän naapurin mallia. [2]

Muuntoprosentit

Nukleiinihappotyyppi Konsentraatio (µg/ml) 1 yksikölle A 260
dsDNA (kaksijuosteinen DNA) viisikymmentä
ssDNA (yksijuosteinen DNA) 37
ssRNA (yksijuosteinen RNA) 40

Kyvetit analysointia varten

Näytteen pitoisuuden määrittämiseksi standardin kyvetissä, jonka optinen reitti on 10 mm, löydetty optinen tiheys on kerrottava sopivalla kertoimella. Esimerkiksi kaksijuosteisen DNA:n 0,9 optisen yksikön absorbanssiarvo vastaa pitoisuutta 45 µg/ml.

Pienikokoiset kyvetit

Monet biologiset tutkimukset ( DNA-mikrosiru , kvantitatiivinen PCR ) edellyttävät pienten nukleiinihappomäärien kvalitatiivista ja kvantitatiivista määritystä. Erikoisnanofotometrit [3] mahdollistavat näytteiden pitoisuuden määrittämisen ilman kyvetin apua submikrolitran tilavuuksina 0,3 μl:sta alkaen. Koska mittaukset tehdään laimentamattomasta näytteestä, tulosten toistettavuus on erittäin hyvä ja itse näytteitä voidaan käyttää analyysin jälkeen.

Näytteen puhtaus

Nukleiinihapponäytteet sisältävät usein proteiinien ja muiden orgaanisten aineiden epäpuhtauksia. Absorbanssisuhdetta aallonpituudella 260 ja 280 nm (A 260/280 ) käytetään usein arvioitaessa valmisteen puhtautta. Puhtaan DNA:n suhde A 260/280 on noin 1,8, RNA-näytteen ilman epäpuhtauksia A 260/280 noin 2.

Proteiiniepäpuhtaudet ja suhde 260:280

Proteiiniepäpuhtauksien havaitsemiseksi nukleiinihappoliuoksissa analysoi liuosten absorptiosuhde aallonpituuksilla 260 ja 280 nm, koska proteiineissa olevat aromaattiset aminohapot absorboivat aallonpituudella 280 nm [1] [4] . Epäpuhtausproteiinien vaikutus nukleiinihappojen pitoisuuden määritykseen on kuitenkin pieni - vain merkittävässä proteiinipitoisuudessa suhde 260:280 siirtyy merkittävästi [1] [5] .

Suhde 260:280 mahdollistaa nukleiinihappojen sekoittumisen määrittämisen proteiiniliuoksissa ja proteiinien sekoittumisen nukleiinihappoliuoksissa:

% orava % nukleiinihappoa suhde 260:280
100 0 0,57
95 5 1.06
90 kymmenen 1.32
70 kolmekymmentä 1.73

Suhde 260:230 on vähemmän herkkä määritettäessä proteiiniepäpuhtauksia nukleiinihappoliuoksessa:

% nukleiinihappoa % orava suhde 260:230
100 0 2.00
95 5 1.99
90 kymmenen 1.98
70 kolmekymmentä 1.94

Tällaiset erot johtuvat nukleiinihappojen molaarisen ekstinktiokertoimen korkeammasta arvosta aallonpituuksilla 260 ja 280 nm proteiineihin verrattuna. Siksi jopa suhteellisen korkean pitoisuuden omaavalla proteiiniliuoksella vaikutus absorptioon aallonpituuksilla 260 ja 280 nm on pieni. Proteiinikontaminaatiota nukleiinihappoliuoksessa ei voida määrittää suhteessa 260:230.

Muu saastuminen
  • Kontaminaatio fenolilla, jota käytetään usein nukleiinihappojen eristämiseen, voi johtaa merkittäviin virheisiin nukleiinihappojen pitoisuuden mittauksessa. Fenolin maksimiabsorptio on 270 nm:ssä ja A 260/280 -suhde on noin 1,2. Fenolittomien nukleiinihappojen A 260/280 -suhde on noin 2 [1] . Fenoliepäpuhtaudet voivat lisätä merkittävästi DNA:n pitoisuutta.
  • Absorptio 230 nm:ssä voi johtua kontaminaatiosta fenolaateilla , tiosyanaateilla ja muilla orgaanisilla yhdisteillä. Puhtaalla RNA-näytteellä suhteen A 260/230 tulisi olla noin 2, puhtaalla DNA-näytteellä A 260/230 noin 1,8. [6]
  • Absorptio aallonpituudella 330 nm ja sitä korkeammalla osoittaa liuoksen muuta kontaminaatiota. Absorption näillä aallonpituuksilla puhtaille nukleiinihappovalmisteille pitäisi olla nolla.
  • Negatiiviset arvot voivat johtua nollanäytteenä käytetyn liuoksen väärästä valinnasta (nolla) tai seurausta fluoresoivan väriaineen läsnäolosta liuoksessa.

DNA- tai RNA-molekyylien lukumäärän määrittäminen tietyillä nukleotidisekvensseillä SlipChip-tekniikalla

Diagnostisia tarkoituksia varten on usein tarpeen määrittää tietyn DNA:n tai RNA:n määrä. On kehitetty erittäin herkkiä menetelmiä DNA:n ja RNA:n määrittämiseen näytteiden mikrotilavuuksista - pisaroista, jotka eivät ylitä muutaman pikolitroja. Tätä varten käytetään PCR :n mikrofluidilaitteita , joissa on yksi kopio nukleiinihaposta [7] [8] [9] [10] .

Muistiinpanot

  1. ↑ 1 2 3 4 Sambrook ja Russell. Molecular Cloning: Laboratory Manual  (määrittämätön) . – 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. - ISBN 978-087969577-4 .
  2. ↑ Tataurov A.V.; You Y., Owczarzy R. Yksijuosteisten ja kaksijuosteisten deoksiribonukleiinihappojen ultraviolettispektrin ennustaminen   // Biophys . Chem. : päiväkirja. - 2008. - Voi. 133 , nro. 1-3 . - s. 66-70 . - doi : 10.1016/j.bpc.2007.12.004 . — PMID 18201813 .
  3. ↑ Kartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, 7. lokakuuta), American Biotechnology Laboratory, http://www.iscpubs.com/Media/PublishingTitles/b0608kar.pdf
  4. ↑ Sambrook ja Russell lainaavat alkuperäistä paperia: Warburg, O. ja Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase  (saksa)  // Biochem. Z. : myymälä. - 1942. - Bd. 310 . - S. 384-421 . )
  5. ↑ Glasel J. Nukleiinihappopuhtauksien validiteetti tarkkailtuna 260 nm/280 nm   absorbanssisuhteilla // BioTechniques : päiväkirja. - 1995. - Voi. 18 , ei. 1 . - s. 62-63 . — PMID 7702855 . )
  6. ↑ DNA:n tai RNA:n analyysi käyttämällä sen aallonpituuksia: 230 nm, 260 nm, 280 nm . Bioteachnology.com (13. tammikuuta 2010). Haettu 12. maaliskuuta 2010. Arkistoitu alkuperäisestä 6. syyskuuta 2012.
  7. ↑ Shen, F., Du, W., Kreutz, JE, Fok, A., & Ismagilov, RF (2010). Digitaalinen PCR SlipChipillä ]. Lab on a Chip, 10(20), 2666-2672. doi : 10.1039/c004521g PMC 2948063
  8. ↑ Jesus Rodriguez-Manzano, Mikhail A. Karymov, Stefano Begolo, David A. Selck, Dmitriy V. Zhukov, Erik Jue, Rustem F. Ismagilov. Yksimolekyylisen digitaalisen RNA:n ja DNA:n isotermisen monistumisen lukeminen nanolitratilavuuksina modifioimattomilla kamerapuhelimilla Arkistoitu 10. toukokuuta 2017 Wayback Machinessa . ACS Nano, 2016; doi : 10.1021/acsnano.5b0733
  9. ↑ Ahrberg, CD, Ilic, BR, Manz, A., & Neužil, P. (2016). Kädessä pidettävä reaaliaikainen PCR-laite. Arkistoitu 4. toukokuuta 2016 Wayback Machine Lab on a Chip., 16, 586-592 doi : 10.1039/C5LC01415H PMID 26753557 PMC 4773913 Saatavilla 2017-01-26
  10. ↑ Zhao Li, Yong Liu, Qingquan Wei, Yuanjie Liu, Wenwen Liu, Xuelian Zhang ja Yude Yu1 (2016). Picoliter Well Array -sirupohjainen digitaalinen rekombinaasipolymeraasiamplifikaatio nukleiinihappojen absoluuttiseen kvantifiointiin . PLOS One.; 11(4): e0153359 doi : 10.1371 /journal.pone.0153359 PMC 4830604