Gram-menetelmä

Kokeneet kirjoittajat eivät ole vielä tarkistaneet sivun nykyistä versiota, ja se voi poiketa merkittävästi 16. heinäkuuta 2019 tarkistetusta versiosta . tarkastukset vaativat 5 muokkausta .

Gram  -menetelmä on tutkimukseen tarkoitettu mikro-organismien värjäysmenetelmä , joka mahdollistaa bakteerien erottamisen niiden soluseinän biokemiallisten ominaisuuksien mukaan . Tanskalaisen lääkärin Hans Christian Gramin ehdottama vuonna 1884 .

Gramin mukaan bakteerit värjätään aniliiniväreillä  - gentianilla tai metyylivioletilla jne., sitten väriaine kiinnitetään jodiliuoksella . Kun värjätty valmiste pestään myöhemmin alkoholilla , sellaisia ​​bakteereja, jotka ovat väriltään tiukasti siniset ja joilla on paksu soluseinä, kutsutaan grampositiivisiksi bakteereiksi, joita kutsutaan gram -positiivisiksi (+) - toisin kuin gram-negatiivisiksi (ohuiksi ). soluseinä), Gram (-) , joka värjäytyi pesussa.

Liuottimella huuhtelun jälkeen Gram-väri lisää kontrastiväristä punaista väriainetta, joka värjää kaikki Gram-negatiiviset bakteerit punaisiksi tai vaaleanpunaisiksi. Tämä johtuu ulkokalvon läsnäolosta, joka estää väriaineen tunkeutumisen soluun. Testi luokittelee bakteerit kahteen ryhmään niiden soluseinän rakenteen perusteella.

Käytä diagnostiikassa

Gram-värjäyksellä on suuri merkitys bakteerien taksonomiassa sekä tartuntatautien mikrobiologisessa diagnosoinnissa.

Gram-positiiviset kokki (paitsi Neisseria - suvun edustajat) ja itiöt kantavat ( Coxiella burnetii -bakteeria lukuun ottamatta) bakteerimuodot värjäävät sinimustaa ( tummansinistä ) väriä .

Monet itiöttömät bakteerit ovat gramnegatiivisia ja värjäytyvät punaisiksi tai vaaleanpunaisiksi.

Värjäystekniikka

Gram-värjäys tarkoittaa monimutkaista värjäysmenetelmää, kun sively altistetaan kahdelle väriaineelle, joista toinen on pääväri ja toinen lisäväri. Väriaineiden lisäksi monimutkaisiin värjäysmenetelmiin käytetään valkaisuaineita: alkoholia, happoja jne.

Gram-värjäykseen käytetään useammin trifenyylimetaaniryhmän aniliinivärejä : gentian, metyylivioletti tai kristallivioletti . Gram-positiiviset mikro-organismit muodostavat vahvan yhteyden ilmoitettujen väriaineiden ja jodin kanssa. Samanaikaisesti ne eivät värjää alkoholille altistuessaan, minkä seurauksena grampositiiviset mikro-organismit eivät muuta alun perin hyväksyttyä violettia väriä lisävärjäyksellä fuksiinilla .

Gram-negatiiviset mikro-organismit muodostavat yhdisteen, jonka alkoholi helposti tuhoaa emäksisten väriaineiden ja jodin kanssa . Seurauksena on, että mikrobit värjäytyvät ja värjäytyvät magentavärillä ja muuttuvat punaisiksi.

Materiaalin valmistelu maalausta varten

  1. Testimateriaali levitetään ohuena kerroksena hyvin rasvattoman lasilevyn pinnalle.
  2. Valmis sively kuivataan ilmassa ja kiinnitetään täydellisen kuivumisen jälkeen.
  3. Histologiset leikkeet valmistetaan standardimenetelmällä kiinnittämällä kudospalat formaliiniin ja kaatamalla ne parafiiniin.

Korjaus

Kiinnittämisen yhteydessä sively kiinnittyy lasilevyn pintaan, ja siksi valmisteen myöhemmän värjäyksen aikana mikrobisoluja ei huuhdo pois. Lisäksi tapetut mikrobisolut värjäytyvät paremmin kuin elävät.

Fysikaalinen kiinnitysmenetelmä, joka perustuu korkean lämpötilan vaikutukseen mikrobisoluun, ja kemialliset menetelmät, joissa käytetään sytoplasman proteiinien koagulaatiota aiheuttavia kemikaaleja, erotetaan toisistaan.

Fyysinen tapa korjata

Valmistetta sisältävä lasilevy otetaan pinseteillä tai oikean käden I ja II sormella kylkiluista vedolla ylöspäin ja tasaisella liikkeellä 2-3 kertaa polttimen liekin yläosan yli. Koko kiinnitysprosessi saa kestää enintään 2 sekuntia.

Kiinnityksen luotettavuus tarkistetaan seuraavalla menetelmällä: tahraton lasilevyn pinta levitetään vasemman käden takapinnalle. Kun sively on kiinnitetty kunnolla, lasin tulee olla kuuma, mutta se ei saa aiheuttaa palovammaa (70-80 ° C).

Kemiallinen kiinnitysmenetelmä

Tahrojen kiinnittämiseen metyylialkoholi , asetoni , Nikiforovin seos ( 96 % etyylialkoholin ja anestesiaesterin seos suhteessa 1:1), Carnoyn nestettä (96 % etyylialkoholia 60 %, kloroformia  30 %, jääetikkaa ) happo  - 10%) ), alkoholi-formoli (40% formaliinia  - 5 ml, 96% etyylialkoholia - 95 ml). Kuivatulla sivellyksellä varustettu objektilasi upotetaan kiinnitysainetta sisältävään pulloon 10-15 minuutiksi ja kuivataan sitten ilmassa. Käytetään myös pareittain 40 % formaliinia muutaman sekunnin ajan.

Levyjen värjäysprosessi

  1. Yksi pääväriaineista kaadetaan kiinteälle siveleelle 2-3 minuutin ajaksi. Saostumisen välttämiseksi tahraa suodatinpaperin läpi.
  2. Valuta maali, poista suodatinpaperi varovasti. Liuos täytetään Lugolin liuoksella tai Gramin jodidiliuoksella (kaliumjodidin ja kiteisen jodin vesiliuos suhteessa 2:1) 1-2 minuutin ajan, kunnes valmiste muuttuu mustaksi.
  3. Liuos valutetaan pois, sively huuhdellaan 96°:n etyylialkoholilla tai asetonilla , kaadetaan ja valutetaan, kunnes sivelyneste on värjäytynyt ja virtaava neste on kirkasta (noin 20-40-60 sekuntia).
  4. Objektilasit pestään perusteellisesti juoksevalla tai tislatulla vedellä 1-2 minuutin ajan.
  5. Gram-negatiivisen bakteeriryhmän tunnistamiseksi valmisteet värjätään lisäksi fuksiinilla tai safraniinilla (2–5 min).
  6. Huuhtele juoksevalla vedellä ja kuivaa suodatinpaperilla.

Gram- Weigertin värjäystekniikka bakteereille histologisissa leikkeissä

  1. Parafiinittomat leikkeet tuodaan veteen.
  2. Värjää 20 minuuttia 1-prosenttisessa pararosaniliinin tai emäksisen fuksiinin 1-prosenttisessa etikkahapossa liuoksessa (väriliuos kuumennetaan kiehuvaksi, jäähdytetään ja suodatetaan).
  3. Pesty 3 kertaa tislatulla vedellä.
  4. Värjää 5 minuuttia 1 % kristallivioletissa tislatussa vedessä.
  5. Huuhtele nopeasti 1-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa.
  6. Käsitelty 30 s seoksessa: 1 osa jodia + 2 osaa kaliumjodidia + 100 osaa tislattua vettä.
  7. Kostuta suodatinpaperilla.
  8. Erottele levittämällä leikkaukseen seosta, jossa on yhtä suuret määrät aniliinia ja ksyleeniä (1-2 ml); liuokset valutetaan, kunnes väripilvet lakkaavat liikkumasta pois leikkauksesta.
  9. Vaihda ksyleeni kolme kertaa.
  10. Pakattu balsamiin tai mihin tahansa ksyleeniin liuotettuun hartsiin.

Tulos: Gram-positiiviset bakteerit ovat sinimustia, fibriini violettia, ytimet punaisia.

Katso myös

Kirjallisuus

Saksaksi
  • Mummi, HCÜber die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten  (saksa)  // Fortschritte der Medizin: magazin. - 1884. - Bd. 2 . - S. 185-189 .
Englanniksi
  • Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter HA Sneath. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology  (englanniksi) . — 9. painos — Lippincott Williams & Wilkins, 1994.
  • Madigan, M.T.; Martinko J; Parker J. Brock Mikro-organismien biologia  (määrittämätön) . – 10. painos. Lippincott Williams & Wilkins, 2004.
  • Ryan, KJ; Ray, C.G. Sherris Medical Microbiology  (määrittämätön) . - 4. painos - McGraw Hill., 2004.
  • Tahrojen käyttö kliinisessä mikrobiologiassa // Biotechnic & Histochemistry, Volume 76, Number 3, 01. toukokuuta 2001, pp. 119-125(7)
  Siirry Wikidata-kohteeseen  Sanakirjat ja tietosanakirjat