Jaksotus

Biopolymeerien sekvensointi ( proteiinit ja nukleiinihapot  - DNA ja RNA ) - niiden aminohappo- tai nukleotidisekvenssin määrittäminen ( latinasta  sequentum  - sekvenssi). Sekvensoinnin tuloksena saadaan muodollinen kuvaus lineaarisen makromolekyylin primäärirakenteesta monomeerisekvenssin muodossa tekstimuodossa. Sekvensoitavien DNA-segmenttien koot eivät yleensä ylitä 100 emäsparia (seuraavan sukupolven sekvensointi) ja 1000 emäsparia Sangerin sekvensoinnissa. Päällekkäisten DNA-osien sekvensoinnin tuloksena saadaan geeniosien sekvenssejä, kokonaisia ​​geenejä, kokonais - mRNA tai organismien täydelliset genomit [1] [2] .

Sekvensointiin käytetään Edmanin , Sangerin ja muiden menetelmiä; tällä hetkellä Sangerin menetelmää dideoksinukleosiditrifosfaatilla ( ddNTP ) käytetään yleisesti geenien sekvensointiin. Yleensä ennen sekvensointia sekvensoitava DNA-jakso monistetaan käyttämällä PCR :ää . Koko genomin sekvensointi suoritetaan yleensä seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoilla .

Sanger-sekvensointi

Dideoksinukleotidimenetelmän tai "ketjun lopetusmenetelmän" kehitti F. Sanger vuonna 1977 , ja sitä käytetään nykyään laajalti DNA:n nukleotidisekvenssin määrittämiseen. Sanger-sekvensointi hybridisoi 17–20 nt:n pituisen synteettisen oligonukleotidin spesifiseen kohtaan yhdessä sekvensoidun kohdan ketjuista. Tämä oligonukleotidi on aluke , joka tarjoaa 3'-hydroksyyliryhmän templaatille komplementaarisen ketjun synteesin aloittamiseksi.

Alukeliuos jaetaan neljään putkeen, joista jokainen sisältää neljä deoksinukleotidiä, dATP, dCTP, dGTP ja dTTP (joista yksi on radioleimattu) ja yksi neljästä 2',3'-dideoksinukleotidistä (ddATP, ddTTP, ddGTP tai ddCTP) . Dideoksinukleotidi sisältyy kaikkiin kohtiin kasvavien ketjujen seoksessa, ja sen kiinnittymisen jälkeen ketjun kasvu pysähtyy välittömästi.

Tämän seurauksena jokaisessa neljästä koeputkesta muodostuu DNA-polymeraasin osallistuessa ainutlaatuinen sarja eripituisia oligonukleotideja, mukaan lukien alukesekvenssi. Lisäksi koeputkiin lisätään formamidia ketjujen erottamiseksi ja elektroforeesi suoritetaan polyakryyliamidigeelissä neljällä kaistalla. Suorita autoradiografia , jonka avulla voit "lukea" sekvensoidun DNA-segmentin nukleotidisekvenssin.

Nykyaikaisemmassa versiossa dideoksinukleotidit leimataan neljällä eri fluoresoivalla väriaineella ja PCR suoritetaan yhdessä putkessa. Sitten polyakryyliamidigeelielektroforeesin aikana lasersäde tietyssä geelin kohdassa herättää väriaineiden fluoresenssin ja ilmaisin määrittää, mikä nukleotidi kulkisi parhaillaan geelin läpi. Nykyaikaiset instrumentit käyttävät kapillaarielektroforeesia DNA-sekvensointiin . [3]

High Efficiency Sequencing

Katso myös

• Edmanin menetelmä
• Bisulfiittisekvensointi
• Pyrosekvensointi
• Seuraavan sukupolven sekvensointimenetelmät
• Yksisoluisen DNA:n sekvensointi

Muistiinpanot

1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Solun molekyylibiologia: kolmessa osassa. - 2. - Moskova: Mir, 1994. - T. 1. - 517 s. - 10 000 kappaletta.  — ISBN 5030019855 .
2. ↑ Knorre D. G., Myzina S. D. Biologinen kemia. - 3. - Moskova: Higher School, 2000. - 479 s. - 7000 kappaletta.  — ISBN 5060037207 .
3. ↑ Glik B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Periaatteet ja soveltaminen. - Moskova: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .

Kirjallisuus

• Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Periaatteet ja soveltaminen. - Moskova: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .

Linkit

• Elämänkoodi: lukeminen ei ole ymmärtämistä
• UniProt.Protein-sekvenssi ja toiminnalliset tiedot.
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4727787/
• https://www.longdom.org/open-access/generations-of-sequencing-technologies-from-first-to-next-generation-0974-8369-1000395.pdf
• https://www.creative-biogene.com/blog/index.php/2016/11/01/brief-introduction-on-three-generations-of-genome-sequencing-technology/
• https://www.nature.com/articles/nbt1486 (2008)

Sanakirjat ja tietosanakirjat	Iso venäläinen