Fluoresenssimikroskopia on menetelmä suurennetun kuvan saamiseksi käyttämällä näytteen virittyneiden atomien ja molekyylien luminesenssia . Käytetään laajasti materiaalitieteen ja biolääketieteen aloilla.
Molekyylit pystyvät absorboimaan valon kvantteja ja siirtymään elektronisesti virittyneisiin tiloihin. Molekyylin paluuta "normaaliin" (perus)tilaan, johon liittyy valon säteily, kutsutaan fluoresenssiksi . Absorptio ja fluoresenssi määräytyvät molekyylin elektronien energiatasojen rakenteen mukaan, ja siksi se on erityinen ominaisuus jokaiselle molekyylityypille (katso yksityiskohdat artikkelista elektronivärähtelyspektroskopia ) .
Biologinen materiaali fluoresoi yleensä hyvin heikosti itsestään, mutta kirkkaiden ja monipuolisten fluoresoivien molekyylien ( fluoroforien ) käytön ansiosta, jotka voivat spesifisesti värjätä kudosten ja solujen eri rakenteita, fluoresenssimikroskopia on osoittautunut erittäin arvokkaaksi biolääketieteen tieteet.
Perinteisillä fluoresenssimikroskopian menetelmillä on huomattavasti pienempi resoluutio verrattuna elektroni- tai atomivoimamikroskopiaan . Toisin kuin jälkimmäinen, optinen mikroskopia mahdollistaa solujen ja jopa pienten organismien sisäisen mikrorakenteen tarkkailun, ei vain kiinteiden, vaan myös elävien. Tästä johtuen fluoresenssimikroskopia on osoittautunut parhaaksi menetelmäksi tutkia organismien toimintamekanismeja solu-, subsellulaarisella ja molekyylitasolla.
Fluoresoivassa mikroskoopissa näytettä säteilytetään valolla korkeammalla taajuudella ja kuva saadaan optisessa spektrissä. Näytteen säteily johdetaan vastaavasti suodattimen läpi, joka katkaisee valon viritystaajuudella. Fluoresoivan valmisteen kuva voidaan kuvata erikoistuneella digitaalikameralla, joka mahdollistaa pitkän valotuksen valokuvien ottamisen. Joidenkin kuvien kohdalla tämä aika voi olla jopa 60 minuuttia.
Fluoresenssimikroskoopin intensiivinen kehitys 1900- ja 2000-luvun vaihteessa johti uusien menetelmien kehittämiseen - kaksifotoni- ja konfokaalimikroskopiaan sekä useisiin lähestymistapoihin, jotka mahdollistivat optisen resoluution diffraktioesteen ja saavuttaa ennennäkemätön nanoresoluutio.
Yksi fluoresenssimikroskopian tyypeistä on konfokaalinen mikroskopia , menetelmä, jonka avulla voidaan saada kuva tietystä näytteen kerroksesta, jolloin päästään eroon ylä- ja alapuolella olevien kerrosten vaikutuksesta. Siten tällä menetelmällä on vertailukelpoinen resoluutio kolmella koordinaattiakselilla. Toinen fluoresenssimikroskopian tyyppi, epifluoresenssimikroskopia, mahdollistaa näytteen pinnan ja kapean pinnanläheisen vyöhykkeen tutkimisen.
TIRFM (Total sisäinen heijastusfluoresenssimikroskopia) perustuu ilmiöön , jossa sähkömagneettinen aaltoheijastus kahden läpinäkyvän aineen välisestä rajapinnasta tapahtuu, kun aalto osuu väliaineesta, jonka taitekerroin on suurempi, kulmassa, joka on suurempi kuin kriittinen kulma (1 /n). Toiseen väliaineeseen tunkeutuvan säteilyn intensiteetti vaimenee eksponentiaalisen lain mukaan, mikä mahdollistaa tämän säteilyn virittämien fluoresoivien kohteiden havaitsemisen ~100 nm paksussa rajakerroksessa jopa 10 nm :n resoluutiolla [1] . Siten TIRFM:ää voidaan perustellusti pitää yhtenä fluoresenssinanoskopian menetelmistä. Biologiassa menetelmällä visualisoidaan solujen plasmakalvoa ja kalvorakenteita.
Viime vuosina fluoresenssimikroskopian alalla on kehitetty useita uusia lähestymistapoja, jotka ovat mahdollistaneet optisen resoluution diffraktioesteen voittamisen ja erittäin korkean ~10 nm:n saavuttamisen. Näitä menetelmiä alettiin yhdistää yleisen termin fluoresenssinanoskopia alle.