Konfokaalinen mikroskopia (confocal laser scanning microscopy, CLSM ( englanniksi confocal laser scanning microscopy )) on valooptisen mikroskoopin tyyppi, jolla on merkittävä kontrasti ja spatiaalinen resoluutio verrattuna klassiseen valomikroskopiaan ja joka saadaan aikaan käyttämällä kuvatasoon sijoitettua neulanreikää (pinhole) ja rajoittaa taustan sironneen valon virtausta, joka ei säteile linssin polttotasosta [1] . Tämä mahdollistaa kuvasarjojen hankkimisen näytteen sisällä olevan polttotason eri syvyyksillä (ns. näytteen optinen leikkaus syvyydessä) ja rekonstruoida sitten kolmiulotteinen kuva näytteestä näistä sarjoista. Konfokaalimikroskopiaa on käytetty laajalti biologiassa, lääketieteessä, materiaalitieteessä ja puolijohdefysiikassa.
Vuonna 1940 Hans Goldmann, silmälääkäri Bernissä, Sveitsissä, kehitti rakolamppujärjestelmän silmätutkimusten dokumentointia varten [2] . Jotkut myöhemmät kirjoittajat pitävät tätä järjestelmää ensimmäisenä konfokaalisena optisena järjestelmänä. [3] [4]
Vuonna 1943 Zun Koana julkaisi konfokaalijärjestelmän. [3] Vuonna 1951 Hiroto Naora, Koanan kollega, kuvasi konfokaalimikroskoopin julkaisussa Science for spektrofotometria [5] .
1950-luvulla biologien oli lisättävä paksuissa kudosleikkeissä olevien fluorokromimerkittyjen esineiden kuvien kontrastia [6] . Tämän ongelman ratkaisemiseksi yhdysvaltalaisen Massachusetts Institute of Technologyn professori Marvin Minsky ehdotti konfokaalisen järjestelmän käyttöä fluoresenssimikroskooppeihin. Vuonna 1957 Minsky sai patentin tälle järjestelmälle [7] .
1960-luvulla tšekkoslovakialainen tiedemies Mojmir Petran Pilsenin Kaarlen yliopiston lääketieteellisestä tiedekunnasta kehitti tandempyyhkäisymikroskoopin, ensimmäisen kaupallisen konfokaalimikroskoopin, joka käytti pyörivää levyä – Nipkow-levyä – useiden virityspistelähteiden luomiseen ja paikallistamiseen. ja säteilyä. [8] [9]
Petran ja hänen kollegansa Milan Hadravsky hakivat Tšekkoslovakian patentin vuonna 1966. David Egger Yalen yliopistosta ja itse Mojmir Petran julkaistiin Science-lehdessä vuonna 1967 [10] , ensimmäinen tieteellinen julkaisu, jossa oli tällä mikroskoopilla saatuja tietoja ja kuvia . Toinen julkaisu vuonna 1968 kuvaa laitteen teoriaa ja teknisiä yksityiskohtia [11] . Keksintö patentoitiin vuonna 1970 Yhdysvalloissa. [12]
Vuosina 1969 ja 1971 tiedemiehet David Egger ja Paul Davidovich Yalen yliopistosta julkaisivat uraauurtavia papereita, joissa kuvattiin ensimmäinen konfokaalinen laserkeilaava mikroskooppi [13] [14] Se oli pisteskanneri, eli vain yksi valopiste luotiin. He käyttivät epi-valaistusta heijastuneessa valossa hermokudoksen tarkkailuun. Koherentin säteilyn lähteenä käytettiin 5 mW helium-neon-laseria , jonka aallonpituus oli 633 nm . Lasersäde heijastui puoliläpinäkyvästä peilistä objektiivin suuntaan . Objektiivi oli yksinkertainen linssi , jonka polttoväli oli 8,5 mm. Toisin kuin kaikki aikaisemmat (ja myöhemmät konfokaalijärjestelmien mallit), näyte skannattiin tämän linssin liikkeellä (objektiivinen skannaus), mikä johti polttopisteen liikkumiseen. Heijastunut valo palautettiin läpikuultavaan peiliin, joka tarkennettiin toisella linssillä kalvolle ( neulanreikä ), jonka taakse asetettiin valomonistinputki . Signaali visualisoitiin CRT - oskilloskoopilla , katodisäde liikkui samanaikaisesti linssin kanssa. Erityisen sovittimen avulla oli mahdollista ottaa valokuvia Polaroid-kameralla. Kolme tällä tavalla saaduista valokuvista julkaistiin vuoden 1971 julkaisussa [14] .
Myös Marvin Minskyn lasersäteilyä käyttävän konfokaalisen pyyhkäisymikroskoopin kaavioita on kehitetty [15] . Jatkossa tutkijoiden päähuomio kohdistui fluoresoivien väriaineiden käytön analysointiin in vivo -tutkimuksissa ja konfokaalisten kuvien laadun parantamiseen fluoresoivan säteilyn voimakkuutta lisäämällä.
Vuonna 1977 Colin J. R. Sheppard ja Amargioti Chowdhury julkaisivat teoreettisen analyysin konfokaalisista ja laserpyyhkäisymikroskoopeista. [16] Tämä oli luultavasti ensimmäinen tieteellinen julkaisu, jossa käytettiin termiä "konfokaalinen mikroskooppi". [17] Vuonna 1978 Christoph Kremer ja Thomas Kremer julkaisivat suunnitelman konfokaaliselle laserpyyhkäisymikroskoopille, jossa käytetään fluoresoivaa viritystä elektronisella automaattitarkennuksella. [18] Tämä CLSM-malli oli ensimmäinen, joka yhdisti laserskannauksen fluoresoivilla markkereilla merkittyjen biologisten objektien volumetriseen havaitsemiseen. Colin Sheppardin ja Tony Wilsonin Oxford-ryhmä kuvaili vuosina 1978 ja 1980 konfokaalista järjestelmää, jossa oli epilaservalaistus, skannausvaihe ja valomonistimet ilmaisimina. Pöytä saattoi liikkua optista akselia pitkin, mikä mahdollisti kolmiulotteisen optisen kerros-kerroksisen leikkaamisen [17] . Vuonna 1979 Fred Brackenhoff ja kollegat osoittivat, että optisen leikkaamisen ja parannetun optisen resoluution teoreettiset edut olivat todellakin saavutettavissa käytännössä. [19] Vuonna 1983 I. Cox ja S. Sheppard julkaisivat ensimmäisen teoksen, jossa konfokaalimikroskooppia ohjattiin henkilökohtaisella tietokoneella. [kaksikymmentä]
1980-luvun puolivälissä William Bradshaw Amos ja John Gralham White ja kollegat Cambridgen molekyylibiologian laboratoriossa rakensivat ensimmäisen konfokaalisen laserpyyhkäisymikroskoopin. [21] [22] Hänen optisessa mallissaan skannaus suoritettiin siirtämällä valonsäde peräkkäin näytteen yli, ei siirtämällä näytetaulukkoa. Tämä järjestelmä mahdollisti merkittävästi lisäämään skannausnopeutta inertiaalisten mekaanisten skannausjärjestelmien hylkäämisen vuoksi ja saavuttamaan jopa neljän kehyksen nopeuden sekunnissa (512 riviä kussakin). [21]
Samanaikaisesti Yhdistyneen kuningaskunnan lääketieteellisen tutkimuksen neuvosto (MRC) sponsoroi modernin kaupallisen konfokaalimikroskoopin prototyypin kehittämistä, jonka Bio-Rad osti myöhemmin, tietokoneohjattu ja kaupallistettu nimellä "MRC 500". MRC 600:n seuraajasta tuli myöhemmin perusta ensimmäisen kahden fotonin fluoresenssimikroskoopin kehittämiselle, joka kehitettiin vuonna 1990 Cornellin yliopistossa. [19]
Tukholman yliopistossa samoihin aikoihin tehty tutkimus muuttui myös kaupalliseksi CLSM Sarastroksi. [23]
Molecular Dynamics [24] osti yrityksen vuonna 1990 , mutta järjestelmän jatkokehityksestä lopulta luovuttiin.
Vuonna 1989 Fritz Karl ja Eckhard Praikschat keksivät pyyhkäisevän laserdiodimikroskoopin hiukkaskokoanalyysiä varten. [25] [26]
Saksassa vuonna 1984 perustettu Heidelberg Instruments kehitti CLSM-teknologiaa, joka oli alun perin tarkoitettu teollisiin sovelluksiin, ei biologiaan. 1990-luvun alussa tätä tekniikkaa kehittivät aktiivisesti Leica Lasertechnik ja Carl Zeiss , jotka tuottivat jo tuolloin menestyksekkäästi valomikroskooppeja toteutetulla lasersäteen skannausjärjestelmällä, jotka myöhemmin päivitettiin konfokaalijärjestelmiksi [27] .
Perinteisen valomikroskoopin optinen kaavio muodostaa kuvan käytetyn mikroobjektin syväterävyysalueella sijaitsevasta näytteen koko osasta ja konfokaalimikroskooppi muodostaa kuvan hyvin ohuesta kappaleesta samalla syvyystasolla. Pohjimmiltaan CLSM-menetelmä saavutetaan ohjaamalla optisen järjestelmän tarkennussyvyyttä.
Konfokaalisen kuvantamisen periaatteen patentoi vuonna 1957 Marvin Minsky [28] [29] , ja sen tavoitteena on voittaa joitakin perinteisten fluoresenssimikroskooppien rajoituksia. Perinteisessä (laajakenttä) fluoresoivassa mikroskoopissa koko näyte on tasaisesti valaistu mikroskoopin säteilylähteellä. Tässä tapauksessa koko näyte säteilytetään ja viritetään samanaikaisesti, ja tuloksena oleva fluoresenssi havaitaan käyttämällä valodetektoria tai mikroskooppikameraa, mukaan lukien suuri taustaosa esineestä. Sitä vastoin konfokaalinen mikroskooppi käyttää kohdevaloa (katso Point Spread Function ) ja neulanreikää ilmaisimen edessä olevassa optisessa konjugoidussa tasossa epätarkennetun signaalin poistamiseksi. Fluoresoivaa säteilyä havaitaan siis vain polttotasolta, joten kuvan optinen tarkkuus erityisesti Z-akselilla (näytteen syvyyttä pitkin) on paljon suurempi kuin perinteisillä valomikroskoopeilla. Koska suurin osa näytteen fluoresenssista on kuitenkin estetty, resoluution kasvuun liittyy hyödyllisen signaalin intensiteetin lasku. Tämän sivuvaikutuksen kompensoimiseksi käytetään pidempää ilmaisimen valotusta ja erittäin herkkiä valoilmaisimia, yleensä PMT- tai lumivyöryvalodiodia , jotka muuntavat optisen signaalin sähköiseksi, minkä jälkeen rekisteröinti tapahtuu henkilökohtaisella tietokoneella [30] .
Koska näytteeseen on tallennettu vain yksi fluoresoiva piste, näytteen rasteriskannaus tarvitaan 2D- tai 3D-kuvan muodostamiseksi. Lasersäde liikkuu näytettä pitkin vaakatasossa käyttämällä yhtä tai useampaa peiliä, joiden kallistuskulma on säädelty. Tällä skannausmenetelmällä on yleensä alhainen skannausnopeus, joka voi kuitenkin vaihdella. Esimerkiksi hitaampi skannaus tarjoaa paremman signaali-kohinasuhteen, mikä parantaa kontrastia ja korkeampaa resoluutiota.
Kuten tiedetään, CLSM:n syväterävyys on suoraan verrannollinen käytetyn säteilyn aallonpituuteen ja kääntäen verrannollinen mikroobjektiivin numeeriseen aukkoon, ja se riippuu myös näytteen optisista ominaisuuksista. Tästä johtuen 3D-objektien pisteen ohjelmistorekonstruktio tapahtuu CLSM:ssä erilaisten algoritmien avulla. Yleisin on intensiteetin maksimihakualgoritmi. [31]
Konfokaalimikroskoopilla on sama resoluutio kuin perinteisellä mikroskoopilla, ja sitä rajoittaa diffraktioraja .
missä on säteilyn aallonpituus, on objektiivin numeerinen aukko, on näytteen ja objektiivin välisen väliaineen taitekerroin, on puolet objektiivin "vantaa" kulmasta. Näkyvällä alueella resoluutio on ~ 250 nm (NA=1,45, n=1,51) Viime vuosina on kuitenkin onnistuttu kehittämään mikroskooppimalleja, jotka hyödyntävät näytteiden fluoresenssin epälineaarisia ominaisuuksia. Tässä tapauksessa saavutetaan resoluutio, joka on paljon pienempi kuin diffraktioraja ja on ~ 3–10 nm [32] [33] [34] [35] .
Tarkastellaan nyt kysymystä kontrastin lisäämisestä käytettäessä konfokaalista optista mallia. Ensinnäkin, koska valo kulkee linssin läpi kahdesti konfokaalimikroskoopissa, pisteen hämärtymistoiminnolla (jäljempänä PSF ) on seuraava muoto:
,
jossa Pconf on konfokaalipisteen sumennusfunktio ja p on tavallinen pisteen sumennustoiminto.
Näin ollen polttotason saavutettava paksuus määräytyy pääasiassa käytetyn säteilyn aallonpituuden jaettuna objektiivin numeerisella aukolla, ja se riippuu myös näytteen optisista ominaisuuksista. Ohuen optisen poikkileikkauksensa ansiosta tämäntyyppiset mikroskoopit ovat erityisen hyviä 3D-kuvaukseen ja näytteiden pintaprofilointiin.
Peräkkäiset viipaleet muodostavat "z-pinon", jonka tietyt ohjelmistot voivat käsitellä 3D-renderöidyn kuvan luomiseksi tai esittää 2D-pinossa julkaisua varten yhteisen intensiteetin maksimihakualgoritmin ansiosta. [31]
Konfokaalimikroskopia tarjoaa suoran, ei-invasiivisen peräkkäisen optisen leikkaamisen koskemattomista paksuista elävistä näytteistä minimaalisilla valmisteluvaatimuksilla sekä korkeamman lateraalisen resoluution verrattuna tavanomaiseen valomikroskopiaan [36] [37] . Tyypillisesti biologiset näytteet vastavärjätään fluoresoivilla väriaineilla niiden erityisten alueiden tai organellien visualisoimiseksi. Todellinen väriainepitoisuus voidaan kuitenkin pitää hyvin alhaisena biologisiin järjestelmiin kohdistuvan vaikutuksen minimoimiseksi. Siten jotkin konfokaaliset järjestelmät voivat seurata yksittäisiä fluoresoivia molekyylejä [38] . Lisäksi siirtogeenisillä tekniikoilla voidaan luoda organismeja, jotka tuottavat omia fluoresoivia kimeerisiä molekyylejä (merkitty GFP:llä, vihreällä fluoresoivalla proteiinilla) [39] .
Konfokaalinen laserpyyhkäisymikroskooppi, jossa on suuri kontrasti, tarjoaa kaksi korvaamatonta mahdollisuutta: sen avulla voit tutkia kudoksia solutasolla fysiologisen elinvoimaisuuden tilassa sekä arvioida solutoiminnan tuloksia (dynamiikkaa) neljässä ulottuvuudessa - korkeus, leveys, syvyys ja aika. [40]
Käyttämällä Rayleigh-kriteeriä erottelukyvyssä (dip 26% jakauman maksimista) havaitsemme, että resoluutio konfokaalimikroskoopissa kasvaa, mutta ei merkittävästi. Konfokaalimikroskoopin resoluutio (r c ) määritellään seuraavasti [8] [41] [1] :
,
jossa n on suhteellinen taitekerroin, D on optisen järjestelmän sisääntulopupillin halkaisija, λ on aallonpituus, F on mikroobjektiivin polttoväli, θ on mikroobjektiivin aukkokulma, λ'=λ/n . Perinteiselle valomikroskoopille resoluutio (r r ):
Konfokaalimikroskoopin tärkein etu ei kuitenkaan ole Rayleigh-kriteerin mukainen resoluution kasvu, vaan kontrastin merkittävä lisäys. Erityisesti tavanomaisten polyesterikatkokuitujen polttotasossa ensimmäisen lateraalimaksimin amplitudin suhde päämaksimin amplitudiin on 2 %; konfokaalimikroskoopin tapauksessa tämä suhde on 0,04 %.
Konfokaalimikroskopia lisää kuvan kontrastia käyttämällä tarkennettua valaistusta (viritystä) analyysialueella ja fluoresenssiiiristä kuvatasossa. Tämä kontrastin lisäys mahdollistaa objektien erottelun intensiteetissä jopa 200:1, ja se lisää myös resoluutiota sekä objektitasolla että optisella akselilla. Kontrastin lisäämisen ohella fluoresoiva konfokaalinen mikroskopia mahdollistaa tutkittavan kohteen vaiheittaisen kolmiulotteisen rekonstruoinnin monipistevalaistuksen avulla. Edistyneimmistä konfokaalimikroskopian skannausmenetelmistä on korostettava mikrokalvoilla varustetun skannauslevyn käyttöä ja matriisivalodetektorien käyttöä [2] .
Nykyään on olemassa menetelmiä, joilla voidaan merkittävästi lisätä konfokaalimikroskoopin resoluutiota. Perinteisessä konfokaalimikroskoopissa viritysvalo kohdistetaan yhteen kohtaan näytteessä, minkä jälkeen havaitaan emissiofluoresoiva signaali. Epätarkka emissiosäteily katkaistaan neulanreiällä (pinhole), jonka koko määrittää kuinka monta Airy-kiekon maksimiarvoa saavuttaa ilmaisimen. Resoluutiota voidaan lisätä pienentämällä kalvon (neulanreiän) halkaisijaa, mutta signaali-kohinasuhde pienenee merkittävästi kalvon läpi kulkevan emissiosäteilyn intensiteetin pienenemisen vuoksi. Vaihtoehtona tällaiselle skannaukselle on joukkotunnistimien [42] [43] käyttö , jotka rekisteröivät samanaikaisesti intensiteetin jakauman näytteen sivutasolla samanaikaisesti koko Airy-levyn alueelta, jossa jokainen valoherkkä elementti toimii reikäinen aukko. Siten käyttämällä tunnistusalgoritmia 32-kanavaisella matriisidetektorilla (Airyscan [44] [45] ), osoitettiin, että on mahdollista ylittää klassinen resoluutioraja (diffraktioraja) yli 1,7 kertaa kaikissa kolmessa ulottuvuudessa: 140 nm asti lateraalisesti ja 400 nm aksiaalisesti aallonpituudella 488 nm [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] .
CLSM:ää käytetään laajalti lähes kaikilla biologian aloilla solubiologiasta ja genetiikasta mikrobiologiaan ja kehitysbiologiaan. Sitä käytetään myös kvanttioptiikassa ja nanokiteisessä kuvantamisessa ja spektroskopiassa.
Biologia ja lääketiedeKliinisesti CLSM:ää käytetään erilaisten silmäsairauksien tutkimiseen ja erityisesti sarveiskalvon endoteelisolujen kuvantamiseen, kvalitatiiviseen analyysiin ja kvantifiointiin [53] . Sitä käytetään lokalisoimaan ja tunnistamaan rihmamaisten sienifilamenttien esiintyminen sarveiskalvon stroomassa keratomykoosin tapauksissa, mikä mahdollistaa nopean diagnoosin ja oikean hoidon varhaisen antamisen. Lupaavalta vaikuttaa myös endoskooppisten toimenpiteiden ( endomikroskopia ) suorittaminen CLSM-menetelmällä [54] . Lääketeollisuudessa suositeltiin tämän lähestymistavan käyttöä ohutkalvolääkemuotojen tuotantoprosessin seuraamiseen, lääkeaineiden laadun ja jakelun tasaisuuden valvomiseen.
Optiikka ja kristallografiaCLSM:ää käytetään tietojen palautusmekanismina joissakin 3D-optisissa tiedontallennusjärjestelmissä tai kemiallisten yhdisteiden kartoituksessa sekä puolijohdefysiikassa ja spintroniikassa (erityisesti NV-keskusten ominaisuuksien tutkimuksessa ). [55] [56] .
Sarja konfokaalisia kuvia (z-pino), jotka osoittavat aktiinifilamenttien jakautumisen U2OS-osteosarkoomasolulinjassa
3D-rekonstruktio sarjasta konfokaalisia kuvia kiinteän HeLa-solujen ytimestä, siirtogeeninen kimeerinen proteiinihistoni H2B-GFP
Leikkaus Pteridium aquilinum -lehdestä
Konfokaalinen kuva Lycopodium annotinum -varren poikkileikkauksesta
Poikkileikkaus Dryopleris filix-mas -lehdestä
Konfokaalinen kuva kolikon fragmentista "1 euro"
Kaksikanavainen konfokaalinen kuva mitoottisista mikrotubuluksista
Sanakirjat ja tietosanakirjat | |
---|---|
Bibliografisissa luetteloissa |