Helicase-dependent amplifikaatio ( englanniksi Helicase-dependent amplificatio, HDA ), myös Helicase-dependent isothermal amplifikaatio , on in vitro DNA :n monistusmenetelmä (samanlainen kuin polymeraasiketjureaktio ), joka suoritetaan vakiolämpötilassa.
Polymeraasiketjureaktio on laajimmin käytetty in vitro DNA :n monistustekniikka molekyylibiologian ja biolääketieteellisen tutkimuksen tarkoituksiin [1] . Tämä prosessi sisältää kaksijuosteisen DNA:n erottamisen korkeassa lämpötilassa yksijuosteiseksi ( denaturaatiovaihe , yleensä saavutetaan 95-97 °C:ssa), alukkeiden liittämisen yksijuosteiseen DNA:han (pariutumisvaihe) ja yksijuosteisen DNA:n kopioimisen. uusi kaksijuosteinen DNA (pidennysvaihe, joka vaatii DNA-polymeraasia), joka vaatii reaktion suorittamisen lämpösyklilaitteessa . Nämä pöytäkoneet ovat suuria, kalliita ja vaativat korkeita käyttö- ja ylläpitokustannuksia, mikä rajoittaa DNA-monistuksen mahdollista soveltamista laboratorion ulkopuolisissa tilanteissa (esim. mahdollisesti vaarallisten mikro-organismien tunnistaminen tutkimus- tai potilaan hoidossa). Vaikka PCR yhdistetään yleisesti lämpökiertoon, alkuperäinen Mullis et ai. esitetään helikaasin käyttö keinona denaturoida kaksijuosteista DNA:ta, joka sisältää nukleiinihappojen isotermisen monistamisen . Luonnollisissa olosuhteissa DNA replikoituu DNA-polymeraasien avulla erilaisten apuproteiinien, mukaan lukien DNA-helikaasien, avulla, jotka erottavat DNA:n purkamalla DNA:n kaksoiskierrettä [2] . HDA kehitettiin tästä konseptista käyttämällä helikaasia (entsyymiä) DNA:n denaturointiin.
Kaksijuosteisen DNA:n säikeet erotetaan ensin DNA-helikaasilla ja päällystetään yksijuosteisella DNA:ta (ssDNA) sitovilla proteiineilla. Toisessa vaiheessa kaksi sekvenssispesifistä aluketta hybridisoidaan DNA-templaatin kuhunkin reunaan. DNA-polymeraaseja käytetään sitten pidentämään templaatteihin kiinnitettyjä alukkeita kaksijuosteisen DNA:n tuottamiseksi, ja DNA-helikaasit käyttävät sitten kahta vasta syntetisoitua DNA-tuotetta substraatteina päästäkseen seuraavalle reaktiokierrokselle. Siten kehittyy samanaikainen ketjureaktio, joka johtaa valitun kohdesekvenssin eksponentiaaliseen monistumiseen (katso Vincent et ai. , 2004 [3] kaaviosta ).
Löytönsä julkaisemisesta lähtien HDA-tekniikkaa on käytetty "yksinkertaiseen, erittäin mukautuvaan nukleiinihappotestiin Clostridium difficilen havaitsemiseksi" [4] . Muita sovelluksia ovat Staphylococcus aureuksen nopea havaitseminen monistamalla ja tälle bakteerille spesifisen lyhyen DNA-sekvenssin havaitseminen. HDA:n etuna on, että se tarjoaa nopean menetelmän spesifisen kohdenukleiinihapon monistamiseksi isotermisessä lämpötilassa ilman lämpösyklilaitteen käyttöä. Tutkija vaatii kuitenkin etukäteen alukkeiden ja joskus puskurien optimoinnin. Tyypillisesti alukkeiden ja puskurien optimointi varmistetaan ja saavutetaan PCR:llä, mikä herättää kysymyksen lisäkustannusten tarpeesta erilliselle järjestelmälle varsinaista amplifikaatiota varten. Vaikka HDA ei vaadi lämpösyklilaitteen käyttöä ja mahdollistaa siksi kenttätutkimuksen, suurin osa mahdollisesti haitallisten mikro-organismien tunnistamiseen tarvittavasta työstä tehdään tutkimus-/sairaalalaboratorioissa. Tällä hetkellä massadiagnostiikkaa suurelle määrälle näytteitä ei vielä voida saavuttaa HDA:lla, kun taas PCR-reaktiot, jotka suoritetaan lämpösyklilaitteessa, johon mahtuvat monikuoppaiset näytelevyt, mahdollistavat kohde-DNA-kohteen monistamisen ja havaitsemisen jopa 96 näytteestä. HDA-reagenssit ovat myös suhteellisen kalliimpia kuin PCR-reagenssit, varsinkin kun ne toimitetaan sarjana.