Immuno-PCR [1] ( eng. immuno-PCR ) on yliherkkä menetelmä antigeenien havaitsemiseksi perustuen niiden spesifiseen vuorovaikutukseen vasta -aineiden kanssa ja tämän vuorovaikutuksen havaitsemiseen käyttämällä polymeraasiketjureaktiota (PCR). Immuno-PCR-menetelmä on monella tapaa samanlainen kuin entsyymi- immunosorbenttimääritys (ELISA), mutta entsyymin sijaan se käyttää antigeeni-vasta-ainekompleksin havaitsemiseen DNA-fragmenttia , jonka määrä kasvaa eksponentiaalisesti PCR:n aikana. Tämän DNA-fragmentin monistuminen reaktioseoksessa on menetelmän analyyttinen signaali [2] .
Immuno-PCR-menetelmää ehdotettiin vuonna 1992. Sitten Kalifornian yliopiston tutkijat käyttivät sitä naudan seerumialbumiinin (BSA) havaitsemiseen. Heidän kokeessaan havaitsemisraja oli viisi suuruusluokkaa korkeampi kuin standardin ELISA:n, 580 molekyyliä näytettä kohti [2] [3] .
Immuno-PCR-menetelmä on ELISA :n ja PCR :n yhdistelmä . Näistä ensimmäistä käytetään, jos kliinisessä diagnostiikassa halutaan havaita hormoneja , vasta -aineita , proteiineja tai myrkkyjä . Eri spesifisyyksien vasta-aineiden saatavuuden vuoksi tämä menetelmä mahdollistaa monenlaisten antigeenien havaitsemisen . ELISA:n herkkyys on kuitenkin suhteellisen alhainen. Toisaalta laajalti käytetty PCR-menetelmä auttaa havaitsemaan hyvin pieniä määriä DNA:ta. Teoriassa yksikin kopio havaittavasta DNA:sta testinäytteessä riittää virus- ja bakteerisairauksien tai perinnöllisten sairauksien diagnosoimiseen. Immuno-PCR:n ideana on edelleen havaita erilaisia antigeenejä spesifisillä vasta-aineilla, mutta saada positiivinen signaali tästä havaitsemisesta ei entsyymin avulla, kuten ELISA:ssa, vaan DNA-tunnisteen avulla, kuten PCR [4] .
Immuno-PCR:n ensimmäisessä vaiheessa suoritetaan immunokemiallinen reaktio näytteessä olevan analysoitavan yhdisteen ja vasta-aineen välillä. Analogisesti ELISA:n kanssa se toteutetaan eri tavoin. Suorassa versiossa (kuvio 1, A) määritettävän antigeenin sisältävä näyte asetetaan levyn pinnalle ja sitten antigeeni määritetään suoraan spesifisellä vasta-aineella, joka on leimattu DNA:lla. Jos DNA-merkittyä spesifistä vasta-ainetta ei ole saatavilla, se määritetään sekundaarisen (lajin vastaisen) DNA:han sitoutuneen vasta-aineen avulla. Tällaista muotoa kutsutaan epäsuoraksi (kuva 1, B). Antigeenin määrittämiseksi matriiseista ( veriseerumi , plasma ) käytetään "sandwich"-elementtiä (kuvio 1, C). Tätä varten tabletin pinnalle immobilisoidaan alustavasti sitovia vasta-aineita, jotka sitovat antigeenin, kun näyte laitetaan kuoppaan. Epäsuora versio sandwichistä on myös mahdollinen (kuva 2, D) [5] [6] .
Pienen molekyylipainon aineiden määrittämiseen käytetään kilpailevaa muotoa. Tässä tapauksessa detektoiva leimattu vasta-aine ei ole vuorovaikutuksessa vain analysoitavan näytteen antigeenin kanssa, vaan myös kiinteään faasiin immobilisoidun antigeenin kanssa. Mitä enemmän antigeeniä näytteessä on, sitä enemmän liuokseen muodostuu antigeeni-vasta-ainekomplekseja. Näin ollen vähemmän vasta-aineita sitoutuu kiinteään faasiin ja määritys antaa alhaisemman signaalin [5] .
Joissakin tapauksissa aptameerejä voidaan käyttää vasta-aineiden sijasta antigeenien havaitsemiseen . Esimerkiksi R18-RNA-aptameeri sitoutuu spesifisesti kanin IgG:hen . Tätä modifikaatiota kutsutaan immunoaptameriseksi PCR:ksi [7] .
Toisessa vaiheessa, kun antigeeni sitoutuu vasta-aineen ja DNA-tunnisteen konjugaattiin, suoritetaan polymeraasiketjureaktio, jonka seurauksena DNA:n määrä seoksessa kasvaa eksponentiaalisesti. Ensimmäisissä kokeissa amplifikaatiotuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla , mutta tätä varten oli välttämätöntä siirtää reaktioseokset geeliin ja tulokset olivat kvalitatiivisia tai puolikvantitatiivisia . Vaihtoehtona elektroforeesille ehdotettiin reaaliaikaista PCR:ää (RT-PCR): tämän menetelmän avulla voit määrittää DNA-tunnisteen lisäksi myös sen määrän. Kun suoritetaan reaaliaikaista PCR:ää, seokseen lisätään interkaloivaa väriainetta (esimerkiksi SYBR Green I ) tai TaqMan -koetinta ja DNA:n määrä määritetään fluoresenssin intensiteetin mukaan . Monistusvaihe voidaan suorittaa joko samassa putkessa kuin immunokemiallinen reaktio tai DNA-leima voidaan siirtää toiseen putkeen. Toisessa tapauksessa se on ensin leikattava irti restriktioiden avulla tai kuumentamalla 95-100 °C:seen. Samalla todetaan, että yhden koeputken analyysi on huomattavasti vähemmän herkkä [7] [8] .
Teoreettisesti positiivisen signaalin saamiseksi riittää, että yksi DNA-leiman kopio on läsnä reaktioseoksessa. Itse asiassa menetelmän herkkyys vähenee antigeenin ja vasta-aineen vuorovaikutukseen perustuvien vaiheiden vuoksi. Uskon, että immunokemiallisten menetelmien havaitsemisraja yleensä on noin 1000 analyyttimolekyyliä 100 μl:ssa seosta. Monissa julkaisuissa kuvatut immuno-PCR-tekniikat osoittavat herkkyyttä lähellä tätä havainnointirajaa ja jopa alhaisempaa. Jos oletetaan, että tyypillinen proteiini painaa 50-100 kDa, immuno-PCR:n havaitsemisrajan uudelleenlaskenta antaa analyytin pikogrammin luokkaa olevan massan. Tämä herkkyys riittää havaitsemaan monet elimistössä olevat biomarkkerit pieninä pitoisuuksina [9] .
Analyysialusta, kuten ELISA:n tai PCR:n tapauksessa, on 96- kuoppainen mikrotiitterilevy , jonka on kyettävä sitomaan antigeenejä ja oltava lämmönkestävä, jotta PCR voidaan suorittaa suoraan siinä ilman reaktioseoksen siirtämistä toinen lautanen. Yleisiä ovat myös TopYield-polykarbonaattiliuskat, joissa on lisääntynyt sitoutumiskapasiteetti ja jotka on suunniteltu erityisesti immuno-PCR:ää varten. (Vaikka niiden kuoppien muotoon liittyy haittoja: epätasainen lämmön jakautuminen PCR:n aikana ja valon taittumis- ja heijastusvyöhykkeiden ilmaantuminen, mikä vaikeuttaa PCR-käyrien analysointia.) Immuno-PCR suoritetaan myös Corning Costarissa. 6511 polykarbonaattilevyt ja Greiner Thermoquick polykarbonaattilevyt 651570 sekä Robostrips-tabletit [10] .
DNA-fragmentilla leimattu vasta-aine on avaintekijä immuno-PCR:n suorittamisessa. Menetelmän herkkyys ja toistettavuus riippuvat tämän konjugaatin rakenteesta. Vasta-aineen ja DNA:n välisen suhteen luonteen mukaan tällaisten konjugaattien kolme päätyyppiä erotetaan: kimeeriset proteiinit, biotiini-streptavidiinikonjugaatit ja kovalenttiset konjugaatit [11] .
Aluksi immuno-PCR:ssä käytettiin erityistä kimeeristä proteiinia, joka sisälsi proteiini A -fragmentin ja streptavidiinifragmentin . Proteiini A -fragmentti sitoi vasta-aineen ja streptavidiini sitoi DNA:ta biotiinimodifikaatiolla (kuvio 2a). Tällä konjugaatilla on kaksi haittaa. Ensinnäkin kimeeristen proteiinien synteesi on itsessään aikaa vievää. Toiseksi, proteiini A:lla ei ole vain affiniteettia spesifioituun vasta-aineeseen, vaan se on myös epäspesifisesti vuorovaikutuksessa sitoutuvien vasta-aineiden kanssa, joita käytetään määritettäessä immuno-PCR:ää "sandwich"-muodossa. Tästä johtuen taustasignaali ilmaantuu ja menetelmän herkkyys pienenee [2] [4] .
Käytännössä osoittautui yksinkertaisemmiksi luoda biotiinin ja streptavidiinin vuorovaikutukseen perustuva konjugaatti (Kuva 2, B) [12] . Tiedetään, että tetrameeriset proteiinit avidiini (luonnollinen) ja streptavidiini ( geenimuunneltu Streptomyces avidii -viljelmästä ) muodostavat erittäin vakaan kompleksin biotiinin kanssa ( dissosiaatiovakio 10-13-10-15 ) . Biotiini viedään kemiallisesti konjugoituihin molekyyleihin - vasta-aineeseen ja DNA:han, ja sitten nämä molekyylit sekoitetaan streptavidiinin kanssa (se on edullisempaa, koska toisin kuin avidiini, se ei sisällä hiilihydraattifragmentteja, jotka johtavat epäspesifisiin vuorovaikutuksiin) konjugaatin muodostamiseksi [2] [ 13] .
Tämä lähestymistapa ei ole täysin optimaalinen, koska avidiinin tai streptavidiinin neliarvoisuuden vuoksi syntyvillä konjugaateilla voi olla vaihteleva koostumus, mikä vaikuttaa kokeen toistettavuuteen [14] . Myöhemmät tutkimukset tällaisten kompleksien itsekokoamisesta osoittivat kuitenkin, että streptavidiinilla on neliarvoisesta luonteestaan huolimatta taipumus kiinnittää pääasiassa kaksi biotinyloitua DNA-molekyyliä, ja neljän DNA-molekyylin konjugaatteja ei muodostu ollenkaan [15] . Vaadittujen reagenssien kaupallinen saatavuus on muuttanut tämän lähestymistavan "universaaliksi immuno-PCR-protokollaksi" [16] , josta on tullut erittäin suosittu [17] .
Biokonjugaatiomenetelmien kehittämisen ansiosta tuli mahdolliseksi syntetisoida kovalenttisia vasta-aineiden konjugaatteja DNA:n kanssa kemiallisesti käyttämällä bifunktionaalisia silloittimia (kuvio 2, C). Markkinoilla on lukuisia tähän tarkoitukseen tarkoitettuja reagensseja. Konjugointi suoritetaan yleensä DNA:n tai vasta-aineiden aminoryhmien tai tioliryhmien kemiallisella modifioinnilla. Myös napsautuskemiallisiin reaktioihin liittyviä lähestymistapoja kehitetään . Toisaalta tieteellisessä kirjallisuudessa esitetään riittämättömiä tai ristiriitaisia tietoja tällaisten konjugaattien saannosta ja menetelmistä niiden puhdistamiseksi [2] [18] .
Koska kovalenttisissa konjugaateissa havaitseva vasta-aine ja DNA-merkki on liitetty yksilöllisesti (kun taas biotiini-streptavidiinikonjugaateissa ne ovat tasapainokomplekseja), tämä mahdollistaa useiden antigeenien määrittämisen yhdestä näytteestä. Yksi ensimmäisistä tällaisista analyyseistä suoritettiin kolmelle analyytille käyttämällä eripituisia DNA-merkkejä [19] . Interleukiini 6 :ta määritettäessä verrattiin erilaisia lähestymistapoja ja osoitettiin, että kovalenttisten konjugaattien käyttö johtaa 100-kertaiseen herkkyyden kasvuun verrattuna vaiheittaiseen protokollaan [20] .
Immuno-PCR:n kehittämisen päävaiheet: [21]
Immuno-PCR:n herkkyyttä oli mahdollista lisätä käyttämällä antigeenin "kaksoistunnistusta". Proksimaalisen koettimen ligaatiomenetelmä perustuu kahden vasta-aineen käyttöön, jotka ovat spesifisiä määritettävän antigeenin kahdelle vierekkäiselle epitoopille . Näiden vasta-aineiden DNA-merkit eroavat nukleotidisekvenssiltään, mutta niissä on pieniä komplementaarisia alueita. Kun molemmat vasta-aineet ovat vuorovaikutuksessa antigeenin kanssa, niiden DNA-merkit lähestyvät toisiaan avaruudessa ja yhdistyvät sitten ligaasientsyymin vaikutuksesta . Tämä luo uuden DNA-juosteen, joka monistuu. Koska positiivinen signaali on mahdollista vain, jos kaksi vasta-ainetta tunnistaa antigeenin kerralla, tämä kaavio mahdollistaa epäspesifisen sitoutumisen poissulkemisen [22] .
Immuno-PCR:n mahdollisuudet laajenevat, kun analyysissä käytetään erilaisia nanorakenteita. On esimerkiksi ehdotettu magneettisten tai kultaisten nanohiukkasten käyttöä vasta-aineen kantajana . Niiden käyttö helpottaa tarvittavien käsittelyjen suorittamista ja vähentää näytteen vieraiden komponenttien vaikutusta. Molempia nanopartikkeleita käytetään bioviivakoodimäärityksessä : magneettiset nanopartikkelit sisältävät sitovia vasta-aineita, kun taas kultananohiukkaset sisältävät havaitsevia vasta-aineita ja DNA-tunnisteen . Analyysi suoritetaan sandwich-muodossa, jonka jälkeen immunokompleksit kerätään magneetilla ja DNA lohkaistaan kultananohiukkasista jatkoanalyysiä varten. Nimi "bioviivakoodaus" johtuu siitä, että alkuperäisessä julkaisussa ehdotettiin skanometristä analyysimenetelmää. Siten pilkottu DNA konjugoitiin lasipinnalle, jolle oli aiemmin kiinnitetty puolille DNA-ketjua komplementaariset oligonukleotidit. Sitten lisättiin kulta-nanohiukkasia, jotka oli päällystetty hopealla (I) ja jotka sisälsivät oligonukleotidejä, jotka ovat komplementaarisia DNA-merkin toiselle puoliskolle. Sitten hopea palautettiin. Jos järjestelmässä oli DNA-leima ("viivakoodi"), järjestelmä antoi positiivisen signaalin. Tämän menetelmän mahdollisuudet liittyvät useiden analyyttien samanaikaiseen määritykseen, koska oligonukleotidit voivat "koodata" nanopartikkeleita, joilla on ainutlaatuinen oligonukleotidisekvenssi [23] [24] .
Mielenkiintoinen menetelmän kehityskulku on ns. "tadpoles" ( eng. tadpoles ) käyttö. Nämä ovat erityisiä konjugaatteja, joissa proteiinin "pää" on kiinnitetty DNA-häntään. Tällaisten konjugaattien proteiiniosa sisältää histidiinitunnisteen , joka tunnistaa kohdeantigeenin, inteiinin ja kitiiniä sitovan domeenin . Proteiini puhdistettiin kitiiniä sisältävillä pylväillä, inteiini leikattiin pois immobilisoidussa tilassa ja siihen kiinnitettiin kysteiinitähteen sisältävä oligonukleotidi [25] [26] .
On olemassa myös järjestelmiä immuno-PCR:lle, jossa käytetään viruspartikkeleita, liposomeja ja faaginäyttöä [27] .
Vuonna 2010 ehdotettiin Tus-Ter-lukkopohjaisten konjugaattien käyttöä . Tus on proteiini, joka pysäyttää replikaatioprosessin; se sitoutuu tiukasti lyhyisiin Ter-nukleotidisekvensseihin. Tus-Ter-kompleksia käytettiin DNA-tunnisteen ja vasta-aineen stoikiometriseen ja paikkaspesifiseen sitoutumiseen [28] .
Vuodesta 2015 lähtien immuno-PCR-menetelmä on kaupallistettu: sopimustutkimusorganisaatiot ja bioanalyyttiset palvelut tarjoavat palveluita analyyttisten järjestelmien, mukaan lukien GLP -standardien mukaisten, luomiseen [29] .
Useat tutkimusryhmät ovat soveltaneet immuno-PCR-menetelmää tärkeiden proteiinien ja pienimolekyylisten yhdisteiden havaitsemiseen. Samaan aikaan monilla näistä kokeista tutkittiin itse menetelmän mahdollisuuksia, vertailtiin eri formaatteja ja konjugaattityyppejä sekä määritettiin herkkyysrajoja. Näiden tutkimusten tiedot on systematisoitu katsauksissa [30] [31] , ja alla on tärkeimmät tulokset havaittujen analyyttien luokista.
Immuno-PCR:n yleisimmät antigeenit ovat kasvaimiin liittyviä markkeriproteiineja, joita esiintyy niiden kehityksen alkuvaiheessa hyvin pieninä pitoisuuksina. Näistä tärkeimmät ovat syövän alkion antigeeni (CEA) ja eturauhasspesifinen antigeeni (PSA). Eräässä tutkimuksessa immuno-PCR-menetelmän havaittiin olevan noin 1000 kertaa herkempi CEA:lle kuin ELISA [32] , ja myöhemmin herkkyys CEA:lle nostettiin arvoon 13 fg/ml, mikä on 1500 kertaa korkeampi kuin kliinisen herkkyys. menetelmät [33] .
PSA toimi analyytinä kolmen immuno-PCR-formaatin testauksessa, joista herkin oli kovalenttista vasta-aine-DNA-konjugaattia käyttävä formaatti (havaitsemisraja oli 48·105 molekyyliä ) [34] . Magneettisiin nanopartikkeleihin perustuva järjestelmä mahdollisti 0,1 pM PSA:n määrittämisen, joka on 1000 kertaa herkempi kuin ELISA [35] .
Immuno-PCR:ää käytetään virusproteiinien määrittämiseen, koska alkuvaiheessa elimistössä on hyvin pieni määrä virioneja ja ne voidaan määrittää vain erittäin herkillä menetelmillä. Yksi tämän tyyppisistä suosituimmista antigeeneistä on hepatiitti B -viruksen merkkiaine HBsAg : useiden ryhmien työ on alentanut tämän antigeenin havaitsemisrajan immuno-PCR:llä 15 fg:aan reaktiota kohden, ja herkkyysetu ELISAan verrattuna oli 2000-kertainen . 36] . Lisäksi immuno-PCR voi havaita 10 ng HBcAg :tä, toista proteiinia, joka liittyy hepatiitti B -viruksen esiintymiseen kehossa [37] .
P24 - antigeeni on osa HIV-1- viruksen kapsidia ja auttaa tunnistamaan tämän viruksen varhaisessa vaiheessa. Immuno-PCR:n avulla eri kokeissa oli mahdollista havaita 1000 ja 4600 tämän antigeenin molekyyliä [38] . Hantaan-virus havaitaan yleensä nukleokapsidiproteiinin immunomääritysmenetelmillä. Immuno-PCR faaginäytöllä mahdollisti tämän proteiinin havaitsemisen 10 pg/ml, ja kultananohiukkasia käytettäessä herkkyys nousi arvoon 10 fg/ml, mikä on seitsemän suuruusluokkaa parempi kuin ELISA:n tapauksessa [39] . . H5N1 - lintuinfluenssaviruksen määrityksissä immuno-PCR on myös 1000 ja reaaliaikainen PCR parempi kuin ELISA ja 100 kertaa [40] [41] .
Adenovirukset määritetään myös immuno-PCR :llä , ja tällä menetelmällä on etu PCR:ään verrattuna, koska PCR:ää varten on välttämätöntä eristää DNA näytteestä ja immuno-PCR-menetelmässä puhdistus vieraista komponenteista tapahtuu pesuvaiheissa. Immuno-PCR:n herkkyys rotaviruksille kirjallisuustietojen mukaan on sama kuin PCR:n herkkyys. Immuno-PCR-menetelmä on myös hyödyllinen norovirusten havaitsemiseen [42] .
Immuno-PCR:ää käytetään myös patogeenien havaitsemiseen. Esimerkiksi Staphylococcus aureus voidaan tunnistaa sen monista entsyymeistä, proteiineista ja toksiineista, joista merkittävin on proteiini A ja enterotoksiini tyyppi B. Ensimmäinen niistä määritettiin immuno-PCR:llä pitoisuudella 1,10 -17 g/ml, ja toiselle kehitettiin järjestelmiä, jotka mahdollistavat sen määrittämisen sekä puhdasviljelmistä että ruokanäytteistä [43] [44 ] ] . On kuvattu menetelmä Borrelia burgdorferi -bakteerin, Lymen taudin aiheuttajan , havaitsemiseksi spesifisten IgG- ja IgM-vasta-aineiden avulla tätä bakteeria vastaan [45] [46] .
Esimerkkejä bakteeri-, kasvi- ja mykotoksiinien määrittämisestä kuvataan myös . Esimerkiksi botuliinitoksiini deionisoidussa vedessä havaittiin pitoisuutena noin 12 molekyyliä/ml (0,02 fg/ml). Toisessa kokeessa toksoidi A määritettiin pitoisuutena 90 pg/ml. Toksiinit määritettiin myös maidosta (3,75 pg/ml botuliinitoksiinille tyyppi A, 750 pg/ml botuliinitoksoidille tyyppi B, 0,1 pg/ml Shiga-toksiinille tyyppi 2). Risiiniä on löydetty elintarvikkeista pitoisuutena 10-100 pg/ml. Tietoja aflatoksiinin ja polykloorattujen bifenyylien määrityksestä on myös julkaistu [47] .
Joidenkin sairauksien ja häiriöiden diagnoosi ei perustu ulkoisten antigeenien, vaan elimistön itsensä komponenttien, kuten entsyymien , pienimolekyylisten yhdisteiden ja ionien havaitsemiseen. Joissakin tapauksissa immuno-PCR-menetelmää voidaan soveltaa näihin tarkoituksiin. Siten tuumorinekroositekijä havaittiin pitoisuuksina 1 fg/ml asti (50 000 kertaa herkempi kuin ELISA). Alkalinen fosfataasi havaittiin spesifisellä IgG-vasta-aineella 10–11 U [ 48] .
Jotkut antigeenit liittyvät geneettisten häiriöiden ja hermoston sairauksien kehittymiseen. Immuno-PCR:n korkea herkkyys mahdollistaa erittäin alhaisten prionipitoisuuksien havaitsemisen vaikeasti saatavista aivokudoksen ja aivo -selkäydinnesteen näytteistä . On ehdotettu tekniikkaa, jonka avulla on mahdollista määrittää samanaikaisesti kolme hermostoon liittyvää pääproteiinia immuno-PCR:llä: prioni, neuronispesifinen enolaasi ja gliafibrillaarinen hapan proteiini [48] .
Tärkeitä hermoston häiriöiden markkereita ovat tau-proteiinit : vialliset tau-proteiinit ( fosforyloituneet näiden proteiinien epitooppeihin tai isoformeihin ) stabiloivat huonosti mikrotubuluksia , mikä aiheuttaa patologioita. Immuno-PCR mahdollistaa tau-proteiinien viallisten isoformien havaitsemisen pitoisuudella 2-10 pg/ml. Beeta-amyloidia , joka on yksi Alzheimerin taudin alkutekijöistä, havaittiin pitoisuutena 2 amol/l [48] .
Fabryn tautiin liittyy alfa-galaktosidaasi A -geenin puutteita . Yleensä tämä proteiini määritetään ELISA:lla, mutta immuno-PCR antaa 25-kertaisen lisäyksen herkkyyteen [49] .
Immuno-PCR-menetelmä on erittäin herkkä, joten taustasignaalilla on kriittinen rooli siinä, mikä voi häiritä positiivisen tuloksen havaitsemista. Syynä tähän on reaktioseoksen komponenttien epäspesifinen sitoutuminen tai vapaan DNA:n jäämien läsnäolo vasta-aine-DNA-konjugaatissa. Yksittäisiä DNA:ita esiintyy jopa negatiivisissa kontrollinäytteissä, ja niiden läsnäolo näkyy lähes aina 30-40. PCR-syklissä. Immuno-PCR:n optimointi (pesuliuosten valinta, pesun keston pidentäminen, nukleaasien käyttö ) mahdollistaa suurimman eron taustasignaalin ja signaalin välillä koeputkissa, kun antigeenin läsnäolo määritetään. Immuno-PCR:n herkkyydellä on toinenkin haittapuoli: määrityksen laatu heikkenee johtuen reaktioseosten ristikontaminaation tai ympäristön aiheuttamasta kontaminaatiosta. Tämän välttämiseksi immunokemiallisen työn ja PCR:n paikka erotetaan avaruudessa [50] [51] .
Immuno-PCR on työvaltainen menetelmä: analyysi sisältää noin 20 pesuvaihetta ja kokonaisanalyysi kestää 26 tunnista 2 päivään. Analyysiaikaa voidaan lyhentää valmistamalla etukäteen vasta-aine-DNA-konjugaatteja. Muussa tapauksessa ne on valmisteltava analyysin aikana; kun taas inkubaatio- ja pesuvaiheiden lukumäärä kasvaa [52] .