Restriktioendonukleaasit

Restriktioendonukleaasit, restriktioentsyymit ( latinasta  restriktio  - restriktio) - ryhmä entsyymejä , jotka kuuluvat nukleiinihappojen hydrolyysireaktiota katalysoivien hydrolaasien luokkaan .

Toisin kuin eksonukleaasit , restriktioentsyymit eivät katkaise nukleiinihappoja molekyylin päästä, vaan sen keskeltä. Samanaikaisesti jokainen restriktioentsyymi tunnistaa tietyn neljän emäsparin pituisen DNA -osan ja katkaisee nukleotidiketjun tunnistuskohdan sisällä tai sen ulkopuolella.

Bakteerigenomin suojaus omalta restriktioentsyymiltä suoritetaan metyloimalla adeniinin ja sytosiinin nukleotidit (naamiointi) [1] .

Kun restriktio suoritetaan suboptimaalisissa olosuhteissa, endonukleaasit osoittavat tähtiaktiivisuutta (restriktiospesifisyyden lasku).

Luokitus

Restriktioentsyymejä on kolme päätyyppiä (tai luokkaa) , joiden tunnistuskohdat voivat olla symmetrisiä ( palindromisia ) ja asymmetrisiä [2] :

• Ensimmäisen tyypin restriktioentsyymit (esimerkiksi Eco K Escherichia coli K12:sta) tunnistavat tietyn nukleotidisekvenssin ja leikkaavat kaksijuosteisen DNA-molekyylin lähellä tätä sekvenssiä mielivaltaisessa kohdassa, eikä leikkauskohta itsessään ole tiukasti spesifinen (ilmeisesti, DNA-kompleksin muodostumisen jälkeen entsyymi on epäspesifisesti vuorovaikutuksessa DNA:n deletoidun alueen kanssa tai liikkuu DNA-juostetta pitkin).
• Toisen tyypin restriktioentsyymit (esimerkiksi EcoRI , Xbal ) tunnistavat tietyn sekvenssin ja leikkaavat DNA:n kaksoiskierteen tietyssä kiinteässä kohdassa tässä sekvenssissä. Tämän tyyppiset restriktioentsyymit tunnistavat palindromisia sekvenssejä, joilla on keskusakseli ja jotka luetaan tasaisesti symmetria-akselin molemmilta puolilta.
• Kolmannen välityypin restriktioentsyymit (esimerkiksi Eco PI) tunnistavat halutun sekvenssin ja leikkaavat kaksijuosteisen DNA-molekyylin vetäen pois tietyn määrän nukleotidipareja sen päästä (tai useista kohdista eri etäisyyksillä tunnistuskohdasta) . Tässä tapauksessa DNA-fragmentteja muodostuu joko sileillä (tylpyillä) päillä tai ulkonevilla (tahmeilla) 5'- tai 3'-päillä. Nämä restriktioentsyymit tunnistavat asymmetriset kohdat. Näitä ominaisuuksia käytetään laajasti erilaisissa in vitro - DNA - kokoamismenetelmissä , kuten Golden Gate - kokoonpanossa .

Vuoteen 2007 mennessä oli eristetty yli kolme tuhatta restriktioendonukleaasia. [3] Yli kuusisataa restriktaasia on kaupallisesti saatavilla, ja niitä käytetään rutiininomaisesti laboratorioissa DNA-muokkaukseen ja geenitekniikkaan . [4] [5] [6]

Isoskisomeerit

Isoskitsomeerit ovat restriktioendonukleaasipareja, joilla on spesifisyys samojen sekvenssien tunnistamiseen, mutta jotka joskus eroavat metyloituneiden nukleotiditähteiden läsnäolosta , ja jotka leikkaavat nämä sekvenssit samoista kohdista. Esimerkiksi restriktioentsyymit Sph I (CGTAC^G) ja Bbu I (CGTAC^G) ovat isoskitsomeerejä. Ensimmäistä eristettyä entsyymiä tietyn sekvenssin tunnistamiseen ja spesifiseen leikkaamiseen kutsutaan prototyypiksi , ja kaikkia muita samanlaisia ​​restriktioentsyymejä kutsutaan isoskizomereiksi .

Isoskisomeerit eristetään eri bakteerikannoista ja siksi eri isoskisomeerit voivat vaatia erilaisia ​​reaktio-olosuhteita .

Heteroschizomers (neoschizomers)

Entsyymiä , joka tunnistaa saman sekvenssin, mutta katkaisee sen eri tavalla, kutsutaan heteroskitsomeeriksi (neoskizomeeriksi) . Isoskitsomeerit ovat siis heteroskitsomeerien erikoistapaus. Esimerkiksi restriktioentsyymit Sma I (GGG^CCC) ja Xma I (G^GGCCC) ovat heteroskitsomeerejä, mutta eivät toistensa isoskitsomeerejä.

Isocaudomers

Restriktioentsyymejä, jotka tunnistavat täysin erilaiset sekvenssit, mutta muodostavat samat päät, kutsutaan isokaudomereiksi .

Keinotekoiset restriktioentsyymit

Geenitekniikassa käytetään laajasti keinotekoisia restriktaaseja, jotka saadaan fuusioimalla sinkkisormen DNA:ta sitova domeeni nukleaasin DNA:ta leikkaavaan domeeniin [7] [8] . Sinkkisormidomeeni voidaan suunnitella tunnistamaan haluttu DNA-sekvenssi ja sitoutumaan siihen [9] . Vaihtoehto sinkkisorminukleaaseille ovat keinotekoiset restriktioentsyymit TALEN , jotka saadaan fuusioimalla TAL-efektorin DNA:ta sitova domeeni DNA:n katkaisudomeeniin [10] [11] [12] [13] .

RNA-ohjatut endonukleaasit

Ihmissolujen genomin muokkaamiseen käytetään myös CRISPR - Cas9 -järjestelmän endonukleaaseja , jotka katkaisevat tiettyjä DNA-sekvenssejä komplementaarisen RNA:n "kärjestä" [14] [15] [16] [17] [18] [19] . Toisin kuin sinkkisormet ja TALEN, CRISPR-Cas-järjestelmä DNA-tunnistukseen vaatii vain sopivan "opastavan" RNA-sekvenssin luomisen, ei entsyymin uusien proteiinidomeenien luomista, mikä tekee tästä menetelmästä paljon helpommin saavutettavissa sen yksinkertaisuuden vuoksi. ja suhteellisen alhaiset kustannukset [20] [21 ] [22] [23] [24] .

Merkitys

Käytännön molekyylibiologiassa käytetään useimmiten tyypin II restriktioentsyymejä, joiden tunnistuskohta on useimmissa tapauksissa palindromi . Kaikki tyypin II restrikaasit ovat Mg 2+ -riippuvaisia.

Restriktioentsyymit ovat osa monimutkaista restriktio-modifikaatiojärjestelmää, jota bakteerisolut käyttävät säätelemään DNA :n sisältöä ja aktiivisuutta solussa.

Restriktioentsyymien löytäminen 1970-luvulla yhdessä DNA- sekvensointimenetelmien kehityksen kanssa oli tärkein sysäys geenitekniikan kehitykselle .

Tällä hetkellä restriktioentsyymit, joissa on erilaisia ​​tunnistuskohtia, ovat geenitutkimuksen ja geenitekniikan pääväline .

Katso myös

• Rajoitus-muokkausjärjestelmä
• DNA-jalanjälki
• REBASE
• CRISPR Cas13

Muistiinpanot

1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Solun molekyylibiologia: kolmessa osassa. - 2. - Moskova: Mir, 1994. - T. 1. - 517 s. - 10 000 kappaletta.  — ISBN 5030019855 .
2. ↑ Ayala F. D. Moderni genetiikka. 1987.
3. ↑ Roberts RJ, Vincze T., Posfai J., Macelis D.  REBASE - entsyymit ja geenit DNA-restriktioon ja modifiointiin  // Nucleic Acids Res : päiväkirja. - 2007. - Voi. 35 , ei. Tietokantaongelma . - P.D269-70 . doi : 10.1093 / nar/gkl891 . — PMID 17202163 .
4. ↑ Primrose, Sandy B.; Vanha, RW Geenimanipulaation periaatteet: johdatus  geenitekniikkaan . - Oxford: Blackwell Scientific , 1994. - ISBN 0-632-03712-1 .
5. ↑ Micklos, David A.; Bloom, Mark V.; Freyer, Greg A. Laboratorio-DNA-tiede: johdanto yhdistelmä-DNA-tekniikoihin ja  genomianalyysimenetelmiin . — Menlo Park, Kalifornia: Benjamin/Cummings Pub. Co, 1996. - ISBN 0-8053-3040-2 .
6. ↑ Adrianne Massey; Helen Kreuzer. Yhdistelmä-DNA ja biotekniikka: Opas  opiskelijoille . -Washington, DC: ASM Press, 2001. - ISBN 1-55581-176-0 .
7. ↑ Carroll, D. (2011) Genomitekniikka sinkkisormen nukleaasien kanssa. Genetics, 188(4), 773-782. doi : 10.1534/genetics.111.131433
8. ↑ Fujii W, Kano K, Sugiura K, Naito K (2013) Repeatable Construction Method for Engineered Zinc Finger Nuclease Based on Overlap Extension PCR ja TA-Cloning. PLoS ONE 8(3): e59801. doi : 10.1371/journal.pone.0059801
9. ↑ Zhu, C., Gupta, A., Hall, VL et ai. & Wolfe, SA (2013). Määriteltyjen sormi-sormirajapintojen käyttäminen kokoonpanoyksiköinä sinkkisorminukleaasien rakentamiseen. Nucleic acids research, 41(4), 2455-246541 doi : 10.1093/nar/gks1357 .
10. ↑ Mussolino, C., & Cathomen, T. (2012). TALE-nukleaasit: räätälöity genomisuunnittelu on tehty helpoksi. Current Opinion in Biotechnology, 23(5), 644-650 doi : 10.1016/j.copbio.2012.01.013
11. ↑ Beumer, KJ, Trautman, JK, Christian, M., et ai. & Carroll, D. (2013). Sinkkisormen nukleaasien ja transkriptioaktivaattorin kaltaisten efektorinukleaasien vertailu geenikohdistukseen Drosophilassa. G3: Geenit| Genomit| Genetics, 3(10), 1717-1725 doi : 10.1534/g3.113.007260
12. ↑ Sun, N. ja Zhao, H. (2013). Transkriptioaktivaattorin kaltaiset efektorinukleaasit (TALEN): Erittäin tehokas ja monipuolinen työkalu genomin muokkaamiseen. Biotekniikka ja biotekniikka, 110(7), 1811-1821 doi : 10.1002/bit.24890
13. ↑ Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y (2013) Räätälöityjen TALENien nopea kokoonpano useiksi toimitusjärjestelmiksi. PLoS ONE 8(11): e80281. doi : 10.1371/journal.pone.0080281
14. ↑ Cho, SW, Kim, S., Kim, JM ja Kim, JS (2013). Kohdennettu genomitekniikka ihmissoluissa Cas9-RNA-ohjatulla endonukleaasilla. Nature biotechnology, 31, 230-232. doi : 10.1038/nbt.2507
15. ↑ Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA et ai. & Zhang, F. (2013) RNA-ohjattujen Cas9-nukleaasien DNA-kohdistusspesifisyys. Nature biotechnology, 31(9), 827-832. doi : 10.1038/nbt.2647
16. ↑ Golic, KG (2013) RNA-ohjatut nukleaasit: uusi aikakausi malli- ja ei-malliorganismien genomien suunnittelulle. Genetics, 195(2), 303-308. doi : 10.1534/genetics.113.155093
17. ↑ Ran, F.A., Hsu, P.D., Wright, J. et ai. & Zhang, F. (2013). Genomitekniikka CRISPR-Cas9-järjestelmän avulla. Nature protocols, 8(11), 2281-2308 doi : 10.1038/nprot.2013.143
18. ↑ Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) CRISPR-järjestelmän RNA-riippuvainen DNA-endonukleaasi Cas9: Genomieditoinnin pyhä malja? Arkistoitu 5. joulukuuta 2013 osoitteessa Wayback Machine Trends in Microbiology, 21(11), 562-567, doi : 10.1016/j.tim.2013.09.001
19. ↑ Luhan Yang, Prashant Mali, Caroline Kim-Kiselak ja George Church (2014) CRISPR-Cas-välitteinen kohdennettu genomin muokkaaminen ihmissoluissa. Julkaisussa: Gene Correction. Menetelmät ja protokollat. Sarja: Methods in Molecular Biology, Voi. 1114 Storici, Francesca (Toim.) ISBN 978-1-62703-760-0
20. ↑ Uri Ben-David (2013) CRISPR-CAScaden läpi: Tehostaako genomin muokkaaminen soluterapioita? Arkistoitu 17. marraskuuta 2015, Wayback Machine Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi : 10.1186/ 2052-8426-1-3
21. ↑ Neena K. Pyzocha, F. Ann Ran, Patrick D. Hsu ja Feng Zhang (2014) Nisäkässolujen RNA-ohjattu genomieditointi. Julkaisussa: Gene Correction. Menetelmät ja protokollat. Sarja: Methods in Molecular Biology, Voi. 1114 Storici, Francesca (Toim.) ISBN 978-1-62703-760-0
22. ↑ Li, M., Suzuki, K., Kim, NY, Liu, GH ja Belmonte, JCI (2013). Leikkaus ylitse muiden: kohdistetut genomin muokkaustekniikat ihmisen pluripotenteissa kantasoluissa. Journal of Biological Chemistry, jbc-R113. doi : 10.1074/jbc.R113.488247
23. ↑ Slaymaker, IM, Gao, L., Zetsche, B., Scott, DA, Yan, WX ja Zhang, F. Rationally engineeringed Cas9-nukleaasit parannetulla spesifisyydellä  //  Science : Journal. - 2016. - Vol. 351 , nro. 6268 . - s. 84-88 . - doi : 10.1126/science.aad5227 .
24. ↑ Kleinstiver BP, Pattanayak V., Prew MS, , & J. Keith Joung et ai. Korkealaatuiset CRISPR–Cas9-nukleaasit, joilla ei ole havaittavissa olevia genomin laajuisia off-target-vaikutuksia  (englanniksi)  // Nature : Journal. - 2016. - doi : 10.1038/luonto16526 .

Sanakirjat ja tietosanakirjat	Britannica (verkossa) Universalis
Bibliografisissa luetteloissa	J9U : 987007533913205171 LCCN : sh85113284