Biokemiassa ja molekyylibiologiassa sitoutumiskohta (sitoutumiskohta) on makromolekyylin, kuten proteiinin, alue, joka sitoutuu spesifisesti toiseen molekyyliin [1] . Makromolekyylin sitoutumispartneria kutsutaan usein ligandiksi [2] . Ligandeihin voi kuulua muita proteiineja (jotka johtavat proteiini-proteiinivuorovaikutukseen ) [3] [4] , entsyymisubstraatteja [5] , toisia lähettiläitä , hormoneja tai allosteerisia modulaattoreita [6] . Sitoutumistapahtumaan liittyy usein, mutta ei aina, konformaatiomuutos , joka muuttaa proteiinin toimintaa [7] . Sitoutuminen proteiineja sitoviin kohtiin on useimmiten palautuvaa (lyhytaikaista ja ei-kovalenttista), mutta se voi olla myös kovalenttisesti palautuvaa [8] tai irreversiibeliä [9] .
Ligandin sitoutuminen proteiinin sitoutumiskohtaan aiheuttaa usein konformaatiomuutoksen proteiinissa ja johtaa muutokseen solun toiminnassa. Siksi sitoutumiskohdat proteiinissa ovat kriittisiä osia signaalinvälitysreiteissä [ 10] . Ligandityyppejä ovat välittäjäaineet , toksiinit , neuropeptidit ja steroidihormonit [11] . Sitoutumiskohdat käyvät läpi toiminnallisia muutoksia useissa yhteyksissä, mukaan lukien entsymaattinen katalyysi, molekyylireitin signalointi, homeostaattinen säätely ja fysiologinen toiminta. Sähkövaraus , steerinen muoto ja paikan geometria mahdollistavat selektiivisesti erittäin spesifisten ligandien sitoutumisen, mikä aktivoi tietyn soluvuorovaikutuksen sarjan, josta proteiini on vastuussa [12] [13] .
Entsyymit aiheuttavat katalyysiä, sitoutuvat voimakkaammin siirtymätiloihin kuin substraatit ja tuotteet. Useat erilaiset vuorovaikutukset voivat vaikuttaa substraattiin katalyyttisen sitoutumiskohdassa. Ne vaihtelevat sähkökatalyysistä, happo- ja emäskatalyysistä kovalenttiseen katalyysiin ja metalli-ionikatalyysiin [11] . Nämä vuorovaikutukset vähentävät kemiallisen reaktion aktivointienergiaa ja tarjoavat suotuisia vuorovaikutuksia korkean energian molekyylin stabiloimiseksi. Entsyymien sitoutuminen mahdollistaa reaktion kannalta merkityksettömien aineiden lähemmän sijainnin ja poissulkemisen. Tämä spesifinen sitoutuminen estää myös sivureaktioita [14] [11] .
Entsyymityyppejä, jotka voivat suorittaa näitä toimintoja, ovat oksidoreduktaasit, transferaasit, hydrolaasit, lyaasit, isomeraasit ja ligaasit [15] .
Esimerkiksi heksokinaasitransferaasi katalysoi glukoosin fosforylaatiota muodostaen glukoosi-6-fosfaattia . Heksokinaasin aktiivisen kohdan jäännökset mahdollistavat glukoosimolekyylin stabiloinnin aktiivisessa kohdassa ja stimuloivat suotuisten vuorovaikutusten vaihtoehtoisen reitin alkamista, mikä vähentää aktivaatioenergiaa [16] .
Proteiinin estäminen inhibiittorin sitoutumisella voi aiheuttaa reitin, homeostaattisen säätelyn ja fysiologisen toiminnan häiriöitä.
Kilpailevat inhibiittorit kilpailevat substraatin kanssa sitoutumisesta vapaisiin entsyymeihin aktiivisissa kohdissa ja estävät siten entsyymi-substraattikompleksin muodostumisen sitoutumisen yhteydessä. Esimerkiksi hiilimonoksidimyrkytys johtuu hiilimonoksidin kilpailevasta sitoutumisesta hemoglobiinin hapen sijaan.
Vaihtoehtoisesti ei-kilpailevat inhibiittorit sitoutuvat samanaikaisesti substraattiin aktiivisissa kohdissa. Sitoutuessaan entsyymisubstraatti (ES) -kompleksiin muodostuu entsyymisubstraatti-inhibiittori (ESI) -kompleksi. Kuten kilpailevat estäjät, myös tuotteen muodostumisnopeus laskee [5] .
Lopuksi seka-inhibiittorit kykenevät sitoutumaan sekä vapaaseen entsyymiin että entsyymi-substraattikompleksiin. Kuitenkin, toisin kuin kilpailevat ja ei-kilpailevat estäjät, seka-inhibiittorit sitoutuvat allosteeriseen kohtaan. Allosteerinen sitoutuminen aiheuttaa konformaatiomuutoksia, jotka voivat lisätä proteiinin affiniteettia substraattiin. Tätä ilmiötä kutsutaan positiiviseksi modulaatioksi. Sitä vastoin allosteerinen sitoutuminen, joka vähentää proteiinin affiniteettia substraattiin, on negatiivinen modulaatio [17] .
Aktiivisessa kohdassa substraatti sitoutuu entsyymiin aiheuttaen kemiallisen reaktion [18] [19] . Substraatit, siirtymätilat ja tuotteet voivat sitoutua aktiiviseen kohtaan, aivan kuten mitkä tahansa kilpailevat inhibiittorit [18] . Esimerkiksi proteiinin toiminnan yhteydessä kalsiumin sitoutuminen troponiiniin lihassoluissa voi aiheuttaa konformaatiomuutoksia troponiinissa. Tämä sallii tropomyosiinin avata aktiini-myosiinin sitoutumiskohdan, johon myosiinipää sitoutuu muodostaen ristisillan ja indusoimalla lihasten supistumisen [20] .
Veren yhteydessä esimerkki kilpailevasta sitoutumisesta on hiilimonoksidi, joka kilpailee hapen kanssa hemin aktiivisesta kohdasta . Hiilimonoksidin korkea affiniteetti voi ylittää hapen alhaisen happipitoisuuden läsnä ollessa. Näissä olosuhteissa hiilimonoksidin sitoutuminen aiheuttaa konformaatiomuutoksen, joka estää hemiä sitoutumasta happeen, mikä johtaa hiilimonoksidimyrkytykseen [5] .
Säätelykohdassa ligandin sitoutuminen voi lisätä tai estää proteiinin toiminnan [5] [21] . Ligandin sitoutuminen multimeerisen entsyymin allosteeriseen kohtaan indusoi usein positiivista yhteistoimintaa, eli yhden substraatin sitoutuminen saa aikaan suotuisan muutoksen konformaatiossa ja lisää entsyymin sitoutumisen todennäköisyyttä toiseen substraattiin [22] . Säätelykohdan ligandit voivat sisältää homotrooppisia ja heterotrooppisia ligandeja, joissa yksi tai useampi tyyppinen molekyyli vaikuttaa vastaavasti entsyymin aktiivisuuteen [23] .
Säädellyillä entsyymeillä on usein tärkeä rooli aineenvaihduntareiteissä. Esimerkiksi fosfofruktokinaasi (PFC), joka fosforyloi fruktoosia glykolyysin aikana , on voimakkaasti ATP:n säätelemä. Sen säätely glykolyysissä on välttämätöntä, koska se on nopeutta rajoittava vaihe aineenvaihdunnassa. FFK säätelee myös glukoosin määrää, joka on tarkoitettu ATP:n muodostumiseen katabolisen reitin kautta. Siksi riittävällä ATP-tasolla ATP estää PFK:ta allosteerisesti. Tämä asetus säästää tehokkaasti glukoosivarastoja, joita muut reitit saattavat vaatia. Sitraatti, sitruunahappokierron välituote, toimii myös PPA:n allosteerisena säätelijänä [23] [24] .
Sidontakohteita voidaan luonnehtia myös niiden rakenteellisilla ominaisuuksilla. Yksijuosteiset kohdat ("monodesmiset" ligandit, μόνος: yksittäinen, δεσμός: sitoutuminen) muodostuvat yhdestä proteiiniketjusta, kun taas monijuosteisia paikkoja ("polydesmiset" ligandit, πολοί: monia) löytyy usein proteiinikomplekseista [25] ja niitä muodostavat ligandit, jotka sitovat useampaa kuin yhtä proteiiniketjua, yleensä proteiinirajapinnoissa tai niiden lähellä. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että sitoutumiskohdan rakenteella on vahva vaikutus proteiinikompleksien biologiaan (toiminnan evoluutio, allosteria) [26] [27] .
Piilotetut sitoutumiskohdat ovat sitoutumiskohtia, jotka muodostuvat tilapäisesti "apo"-muodossa tai joita ligandin sitoutuminen indusoi. Piilotettujen sitoutumiskohtien huomioon ottaminen kasvattaa potentiaalisesti lääkeaineresponsiivisen ihmisen proteomin kokoa noin 40 %:sta ~ 78 %:iin sairauteen liittyvistä proteiineista [28] . Sitoutumiskohtia on tutkittu käyttämällä: CryptoSite-tietoaineistoon sovellettua tukivektorikonetta [ 28] , CryptoSite-tietojoukon laajennusta [29] , pitkäaikaisia molekyylidynamiikan simulaatioita Markovin tilamallilla ja biofysikaalisia kokeita [30] ja piilotettujen sivustojen indeksi, joka perustuu suhteelliseen käytettävissä olevaan pinta-alaan [31] .
Sitoutumiskäyrät kuvaavat ligandin sitoutumisprosessia proteiiniin. Käyriä voidaan luonnehtia niiden muodolla, sigmoidisella tai hyperbolisella, mikä heijastaa sitä, onko proteiinilla yhteistoiminnallista vai ei-yhteistoiminnallista sitoutumiskäyttäytymistä, vastaavasti [32] . Tyypillisesti x-akseli kuvaa ligandin pitoisuutta ja y-akseli kuvaa kaikkiin saatavilla oleviin sitoutumiskohtiin liittyvien ligandien fraktionaalista kyllästymistä [5] . Michaelis Menten -yhtälöä käytetään yleisesti käyrän muodon määrittämisessä. Michaelis Menten -yhtälö johdetaan stationaaristen olosuhteiden perusteella ja ottaa huomioon liuoksessa tapahtuvat entsymaattiset reaktiot. Kuitenkin, kun reaktio tapahtuu, kun entsyymi on sitoutunut substraattiin, kinetiikka kehittyy eri tavalla [33] .
Mallintaminen sitoutumiskäyrillä on hyödyllinen arvioitaessa hapen sitoutumisaffiniteettia hemoglobiiniin ja myoglobiiniin veressä. Hemoglobiini, jossa on neljä hemiryhmää, sitoutuu yhteistyöhön . Tämä tarkoittaa, että hapen sitoutuminen hemoglobiinin hemiryhmään aiheuttaa suotuisan konformaatiomuutoksen, mikä mahdollistaa suotuisan hapen sitoutumisen lisäämisen seuraaville hemiryhmille. Näissä olosuhteissa hemoglobiinin sitoutumiskäyrä on sigmoidinen, koska sen kyky sitoutua happeen on lisääntynyt. Koska myoglobiinilla on vain yksi hemiryhmä, se sitoutuu ei-yhteistyöhön, joka on hyperbolinen sitoutumiskäyrällä [34] .
Biokemialliset erot eri organismien ja ihmisten välillä ovat hyödyllisiä lääkekehityksessä. Esimerkiksi penisilliini estää bakteerien DD-transpeptidaasientsyymejä , häiritsee bakteerien soluseinän synteesiä ja aiheuttaa solukuolemaa. Sitoutumiskohtien tutkiminen on siten merkityksellistä monille tutkimusaloille, mukaan lukien syöpämekanismit [7] , annosmuodot [35] ja fysiologinen säätely [36] . Inhibiittoreiden kehittäminen proteiinien toiminnan suppressoimiseksi on yleinen farmaseuttisen hoidon muoto [37] .
Syövän hoidon alalla käytetään ligandeja, jotka on muokattu näyttämään luonnollisen ligandin kaltaisilta, estämään kasvaimen kasvua. Esimerkiksi kemoterapeuttinen metotreksaatti toimii kilpailevana dihydrofolaattireduktaasin aktiivisen kohdan estäjänä [38] . Tämä vuorovaikutus estää tetrahydrofolaatin synteesiä ja pysäyttää DNA:n, RNA:n ja proteiinien tuotannon [38] . Tämän toiminnan estäminen estää kasvaimen kasvua ja parantaa vaikeaa psoriaasia ja nivelreumaa aikuisilla [37] .
Sydän- ja verisuonisairauksissa lääkkeitä, kuten beetasalpaajia, käytetään verenpainepotilaiden hoitoon. Beetasalpaajat (beetasalpaajat) ovat verenpainetta alentavia lääkkeitä, jotka estävät epinefriini- ja norepinefriinihormonien sitoutumisen sydämen ja verisuonten β1- ja β2-reseptoreihin. Nämä reseptorit välittävät tyypillisesti sympaattista taistele tai pakene -vastetta aiheuttamalla vasokonstriktiota [39] .
Kilpailevia inhibiittoreita on myös kaupallisesti saatavilla. Botuliinitoksiini , joka tunnetaan kaupallisesti nimellä Botox, on hermomyrkky, joka aiheuttaa velttohalvauksen lihaksissa sitoutumalla asetyylikoliinista riippuvaisiin hermoihin. Tämä vuorovaikutus vaimentaa lihasten supistuksia ja antaa sileän lihaksen vaikutelman [40] .
Useita laskennallisia työkaluja on kehitetty ennustamaan proteiinien sitoutumiskohtien sijaintia [21] [41] [42] . Ne voidaan luokitella laajasti sekvenssin tai rakenteen perusteella [42] . Sekvenssipohjaiset menetelmät perustuvat olettamukseen, että proteiinien toiminnallisesti konservoituneiden osien sekvenssit, kuten sitoutumiskohta, ovat konservoituneita. Rakenteeseen perustuvat menetelmät vaativat proteiinin kolmiulotteisen rakenteen. Nämä menetelmät puolestaan voidaan jakaa malli- ja "tasku"-menetelmiin [42] . Mallipohjaiset menetelmät etsivät 3D-samankaltaisuutta kohdeproteiinin ja proteiinien välillä, joilla on tunnetut sitoutumiskohdat. Taskupohjaisilla menetelmillä etsitään kohdeproteiinista koveria pintoja tai piilotaskuja, joilla on ominaisuuksia, kuten hydrofobisuus ja kyky sitoa vetyä, mikä antaisi niille mahdollisuuden sitoa ligandeja suurella affiniteetilla [42] . Vaikka tässä käytetään termiä "tasku", samankaltaisia menetelmiä voidaan käyttää proteiini-proteiinivuorovaikutuksissa käytettyjen sitoutumiskohtien ennustamiseen, jotka ovat yleensä tasaisempia kuin "taskuja" [43] .
| Entsyymit | |
|---|---|
| Toiminta | |
| Säätö | |
| Luokitus | |
| Tyypit |
|