RecBCD

RecBCD ( eksonukleaasi V, RecBC-deoksiribonukleaasi ) on Escherichia coli -bakteerin entsyymi , joka käynnistää homologisen rekombinaatioprosessin korjattaessa ionisoivasta säteilystä johtuvaa DNA- molekyylin kaksi- ja yksijuosteista vauriota , virheitä replikaatioprosessi , virheitä endonukleaasien työssä tai oksidatiivisen stressin seurauksena [1] [2] . RecBCD on sekä helikaasi , joka purkaa DNA: n kaksoiskierrettä , että nukleaasi , joka leikkaa sen [3] .

RecBCD:tä käytetään yksimolekyylisessä FRET -menetelmässä , jolla tutkitaan proteiinien vuorovaikutusta DNA:n kanssa [4] .

Rakenne

RecBCD on proteiinikompleksi, joka koostuu kolmesta eri alayksiköstä : RecB, RecC ja RecD. Ennen RecD -geenin [5] löytämistä kompleksi tunnettiin nimellä RecBC. Jokaista alayksikköä koodaa erillinen geeni:

Toiminnot

RecD ja RecC ovat helikaasseja, eli ATP :llä toimivia molekyylikomplekseja, jotka purkavat DNA:ta tai joissakin tapauksissa RNA :ta , kun taas RecB toimii myös nukleaasina [6] . RecC, RecBCD-kompleksin kolmas alayksikkö, tunnistaa spesifisen sekvenssin DNA:ssa, nimittäin 5'-GCTGGTGG-3 ': n, joka tunnetaan nimellä Chi-kohta, jossa DNA leikataan rekombinaation valmistumisvaiheessa. RecBCD on epätavallinen siinä mielessä, että sen molemmat helikaasit liikkuvat pitkin ketjua eri nopeuksilla [7] ja että ne tunnistavat tietyn DNA-sekvenssin (Chi-kohdan) [8] [9] . RecBCD sitoutuu kaksijuosteisen DNA:n päähän ja alkaa purkaa sitä, kun taas RecD siirtyy 5'-päästä 3'-päähän ja RecB päinvastoin. Liikkeen aikana RecBCD:n taakse jää kaksi DNA-juostetta, jotka muodostavat silmukan, ja koska RecB liikkuu hitaammin kuin RecD, niin jälkimmäisen silmukka kasvaa nopeammin; tuloksena olevaa RecBCD-kompleksin muodossa olevaa rakennetta, joka liikkuu ketjua pitkin ja sen takana on kaksi silmukkaa, kutsutaan joskus "kaninkorviksi" sen ulkoisen samankaltaisuuden vuoksi [10] .

RecBCD:n epäsuoria toimintoja ovat sen rooli bakteeriviljelmää virusinfektiolta suojaavan efektorin aktivoinnissa. [yksitoista]

Toimintamekanismi

DNA:n purkamisen aikana RecB-nukleaasialayksikkö voi toimia eri tavalla riippuen reaktio-olosuhteista, erityisesti riippuen Mg 2+ -ionien ja ATP:n pitoisuudesta. Jos ATP:tä on ylimäärä, entsyymi yksinkertaisesti katkaisee Chi-kohdan sisältävän ketjun [12] . Ketjun purkautuminen jatkuu ja muodostuu 3'-häntä, jossa on Chi-kohta, jolle RecA -proteiini voi laskeutua , mikä helpottaa tämän hännän viemistä kromosomiin , joka toimii mallina vaurioituneiden korjaamiseksi. ketju ja ketjujen vaihto sen kanssa [13] . RecBCD-kompleksin Chi-kohdan tunnistava alayksikkö ei ole vuorovaikutuksessa muiden sekvenssien kanssa, ja entsyymi hajoaa pian alayksiköihin pysyen inaktiivisena tunnin tai kauemmin [14] . Jos Mg 2+ -ioneja on liikaa , RecBCD katkaisee endonukleaasina molemmat DNA-juosteet, vaikka 5'-pää katkaistaan ​​harvemmin [15] . Kun RecBCD kohtaa Chi-kohdan, purkaminen pysähtyy ja 3'-säikeen hajoaminen hidastuu [16] . Samalla kun RecBCD jatkaa DNA:n purkamista, se katkaisee välittömästi vastakkaisen juosteen (eli 5'-pään) [17] [18] ja lataa RecA-proteiinin 3'-päähän. Kun tämä prosessi on saatettu päätökseen yhdessä DNA-molekyylissä, entsyymi toistaa sen uudelleen vaihtaen nopeasti uuteen molekyyliin [13] .

Vaikka reaktioita ei ole varmistettu DNA-analyysillä itse soluissa niiden ohimenevyyden vuoksi, geneettiset tiedot osoittavat, että ensimmäinen reaktio on eniten samankaltainen kuin solussa [1] . Esimerkiksi mutantti RecBCD, jolta puuttuu kokeellisesti määritetty eksonukleaasiaktiivisuus, säilyttää korkean kyvyn katkaista Chi-kohta solunulkoisissa olosuhteissa [19] . Chi-kohta yhdessä DNA-molekyylissä soluissa estää Chi-kohdan aktiivisuutta toisessa, mikä saattaa heijastaa Chi-riippuvaista RecBCD:n hajoamista, joka havaitaan in vitro olosuhteissa, joissa ATP on ylimäärä ja kun DNA:ssa on katkos solussa. Chi-alueen alue [20] [21] .

Molemmissa reaktio-olosuhteissa 3'-pää pysyy ehjänä Chi-kohdan jälkeen, jonka vieressä RecA-proteiini ladataan aktiivisesti DNA-juosteeseen. Jossain määrittämättömässä vaiheessa RecBCD hajoaa, vaikka se voi purkaa ainakin 60 tuhatta emäsparia DNA:ta samalla kun se pysyy ehjänä. RecA aloittaa DNA-säikeiden vaihdon identtisen tai lähes identtisen templaattimolekyylin kanssa; tämä vaihto luo rakenteen, joka tunnetaan nimellä D-silmukka . Syntynyt kahden DNA-dupleksin, joissa on ristikkäiset juosteet, rakenne voidaan selvittää kahdella tavalla: joko 3'-juoste, jonka Chi-kohta on viety templaattimolekyyliin, toimii alukkeena DNA- synteesin aloittamiseksi , tai D-silmukka katkaistaan. muodostamaan Holliday-rakenteen . Holliday-rakenteen puolestaan ​​ratkaisee RuvABC- kompleksi tai RecG-proteiini. Jokainen näistä tapahtumista johtaa kokonaisen DNA:n syntymiseen, joka eroaa vanhemmasta uusilla geeniyhdistelmillä. Tämä prosessi, joka tunnetaan nimellä homologinen rekombinaatio , täydentää kaksisäikeisen katkeamisen korjauksen [13] .

Muistiinpanot

1. ↑ 1 2 Smith GR Kuinka RecBCD-entsyymi ja Chi edistävät DNA-katkon korjausta ja rekombinaatiota: molekyylibiologin näkemys.  (englanniksi)  // Mikrobiologian ja molekyylibiologian katsaukset : MMBR. - 2012. - Vol. 76, nro. 2 . - s. 217-228. - doi : 10.1128/MMBR.05026-11 . — PMID 22688812 .
2. ↑ Spies M., Kowalczykowski SC Homologinen rekombinaatio RecBCD- ja RecF-reiteillä // Bakteerikromosomit  (neopr.) / Higgins P.. - Washington, DC: ASM Press, 2003. - S. 389-403. — ISBN 1-55581-232-5 .
3. ↑ Singleton MR , Dillingham MS , Gaudier M. , Kowalczykowski SC , Wigley DB RecBCD-entsyymin kristallirakenne paljastaa koneen DNA-katkojen käsittelyyn.  (englanniksi)  // Luonto. - 2004. - Voi. 432, nro 7014 . - s. 187-193. - doi : 10.1038/luonto02988 . — PMID 15538360 .
4. ↑ Bianco PR , Brewer LR , Corzett M. , Balhorn R. , Yeh Y. , Kowalczykowski SC , Baskin RJ Prosessiivinen translokaatio ja DNA:n purkaminen yksittäisten RecBCD-entsyymimolekyylien avulla.  (englanniksi)  // Luonto. - 2001. - 18. tammikuuta ( nide 409 , nro 6818 ). - s. 374-378 . - doi : 10.1038/35053131 . — PMID 11201750 .
5.  - 1986. - elokuu ( osa 83 , nro 15 ). - P. 5558-5562 . - doi : 10.1073/pnas.83.15.5558 . — PMID 3526335 .  
6. ↑ Yu M. , Souaya J. , Julin DA RecB-proteiinin 30 kDa:n C-terminaalinen domeeni on kriittinen Escherichia colista peräisin olevan RecBCD-entsyymin nukleaasiaktiivisuudelle, mutta ei helikaasiaktiivisuudelle.  (englanniksi)  // Amerikan yhdysvaltojen kansallisen tiedeakatemian julkaisut. - 1998. - 3. helmikuuta ( nide 95 , nro 3 ). - s. 981-986 . - doi : 10.1073/pnas.95.3.981 . — PMID 9448271 .
7. ↑ Taylor AF , Smith GR RecBCD -entsyymi on DNA-helikaasi, jossa on vastakkaisen polariteetin nopeat ja hitaat moottorit.  (englanniksi)  // Luonto. - 2003. - Voi. 423, nro 6942 . - s. 889-893. - doi : 10.1038/luonto01674 . — PMID 12815437 .
8. ↑ Taylor AF , Smith GR RecBCD-entsyymi muuttuu leikattaessa DNA:ta chi-rekombinaatiopisteessä.  (englanniksi)  // Amerikan yhdysvaltojen kansallisen tiedeakatemian julkaisut. - 1992. - 15. kesäkuuta ( nide 89 , nro 12 ). - P. 5226-5230 . - doi : 10.1073/pnas.89.12.5226 . — PMID 1535156 .
9. ↑ Amundsen SK , Taylor AF , Reddy M. , Smith GR Intersubunit signaling RecBCD-entsyymissä, monimutkaisessa proteiinikoneessa, jota säätelevät Chi hot spotit.  (englanti)  // Geenit ja kehitys. - 2007. - Voi. 21, ei. 24 . - P. 3296-3307. - doi : 10.1101/gad.1605807 . — PMID 18079176 .
10. ↑ Taylor A. , ​​Smith GR DNA:n purkaminen ja kelaus RecBC-entsyymin avulla.  (englanniksi)  // Solu. - 1980. - marraskuu ( osa 22 , nro 2, kohta 2 ). - s. 447-457 . — PMID 6256081 .
11. ↑ Retronit ovat tärkeä osa bakteerien luontaista immuniteettia • Elena Naimark • Tiedeuutisia elementeistä • Genetiikka, mikrobiologia . Haettu 23. marraskuuta 2020. Arkistoitu alkuperäisestä 23. marraskuuta 2020. (määrätön)
12. ↑ Taylor AF , Schultz DW , Ponticelli AS , Smith GR RecBC:n entsyymin nicking Chi-kohdissa DNA:n purkamisen aikana: leikkauksen sijainti ja suuntariippuvuus.  (englanniksi)  // Solu. - 1985. - toukokuu ( osa 41 , nro 1 ) . - s. 153-163 . — PMID 3888405 .
13. ↑ 1 2 3 Anderson DG , Kowalczykowski SC Siirtyvä RecBCD-entsyymi stimuloi rekombinaatiota ohjaamalla RecA-proteiinia ssDNA:han chi-säädellyllä tavalla.  (englanniksi)  // Solu. - 1997. - 11. heinäkuuta ( nide 90 , nro 1 ). - s. 77-86 . — PMID 9230304 .
14. ↑ Taylor AF , Smith GR Homologisen rekombinaation säätely: Chi inaktivoi RecBCD-entsyymin purkamalla kolme alayksikköä.  (englanti)  // Geenit ja kehitys. - 1999. - 1. huhtikuuta ( nide 13 , nro 7 ). - s. 890-900 . — PMID 10197988 .
15. ↑ Dixon DA , Kowalczykowski SC Rekombinaatiohotspot chi on säätelysekvenssi, joka toimii heikentämällä E. coli RecBCD -entsyymin nukleaasiaktiivisuutta.  (englanniksi)  // Solu. - 1993. - 9. huhtikuuta ( osa 73 , nro 1 ). - s. 87-96 . — PMID 8384931 .
16. ↑ Spies M. , Amitani I. , Baskin RJ , Kowalczykowski SC RecBCD-entsyymi vaihtaa lyijymotorisia alayksiköitä vastauksena chi-tunnistukseen.  (englanniksi)  // Solu. - 2007. - Voi. 131, nro. 4 . - s. 694-705. - doi : 10.1016/j.cell.2007.09.023 . — PMID 18022364 .
17. ↑ Taylor AF , Smith GR RecBCD-entsyymin aiheuttaman DNA:n nick-spesifisyys Chi-kohtiin. Modulaatio ATP- ja magnesiumtasojen mukaan.  (englanniksi)  // The Journal Of Biological Chemistry. - 1995. - 13. lokakuuta ( nide 270 , nro 41 ). - P. 24459-24467 . — PMID 7592661 .
18. ↑ Anderson DG , Kowalczykowski SC Rekombinaation hot spot chi on säätelyelementti, joka vaihtaa RecBCD-entsyymin aiheuttaman DNA:n hajoamisen polariteetin.  (englanti)  // Geenit ja kehitys. - 1997. - 1. maaliskuuta ( osa 11 , nro 5 ). - s. 571-581 . — PMID 9119222 .
19. ↑ Amundsen SK , Smith GR Chi hotspot-aktiivisuus Escherichia colissa ilman RecBCD-eksonukleaasiaktiivisuutta: vaikutukset rekombinaatiomekanismiin.  (englanniksi)  // Genetiikka. - 2007. - tammikuu ( osa 175 , nro 1 ) - s. 41-54 . - doi : 10.1534/genetics.106.065524 . — PMID 17110484 .
20. ↑ Köppen A. , Krobitsch S. , Thoms B. , Wackernagel W. Vuorovaikutus rekombinaation hot spot chin kanssa in vivo muuttaa Escherichia colin RecBCD-entsyymin chi-riippumattomaksi rekombinaasiksi inaktivoimalla RecD-alayksikön.  (englanniksi)  // Amerikan yhdysvaltojen kansallisen tiedeakatemian julkaisut. - 1995. - 3. heinäkuuta ( nide 92 , nro 14 ). - P. 6249-6253 . - doi : 10.1073/pnas.92.14.6249 . — PMID 7541534 .
21. ↑ Myers RS , Kuzminov A. , Stahl FW Rekombinaatio hot spot chi aktivoi RecBCD-rekombinaation muuntamalla Escherichia colin recD-mutanttifenokopiaksi.  (englanniksi)  // Amerikan yhdysvaltojen kansallisen tiedeakatemian julkaisut. - 1995. - 3. heinäkuuta ( nide 92 , nro 14 ). - P. 6244-6248 . - doi : 10.1073/pnas.92.14.6244 . — PMID 7603978 .

Sanakirjat ja tietosanakirjat	Britannica (verkossa)