DNA-jalanjälki

DNA - jalanjälki on menetelmä  etsiä DNA -rakenteesta DNA:ta sitovien proteiinien sitoutumissekvenssejä . Tätä menetelmää käytetään tutkimaan proteiinien vuorovaikutusta DNA:n kanssa sekä in vitro (soluista eristettyjen DNA-proteiinikompleksien kanssa) että in vivo ( fysiologisissa olosuhteissa , solun sisällä).

Esimerkiksi transkriptiotekijät sitoutuvat promoottoriin , tehostajiin tai äänenvaimentimiin ja säätelevät yksittäisten geenien ilmentymistä genomissa . DNA-jalanjälkimenetelmän avulla voidaan määrittää DNA-sekvenssit, joihin nämä säätelyproteiinit sitoutuvat. Menetelmä soveltuu myös tiettyyn DNA-sekvenssiin sitoutuvien proteiinien nopeaan etsimiseen ( seulomiseen ).

Menetelmä on saanut nimensä englanninkielisestä sanasta "footprint", joka tarkoittaa jalanjälkeä tai jalanjälkeä. [1] .

Historia

Vuonna 1978 David Galas ja Albert Schmitz kehittivät DNA-jalanjälkitekniikan tutkiakseen repressoriproteiinin sitoutumisspesifisyyttä laktoosioperoniin . Jalanjälkimenetelmä perustui Maxam-Gilbert-sekvensointimenetelmään. [2]

Menetelmä

Tämän menetelmän yksinkertaisin sovellus on määrittää, sitoutuuko proteiini tiettyyn DNA-alueeseen. [3]

1. Käyttämällä polymeraasiketjureaktiota (PCR) haluttu DNA-sekvenssi monistetaan ja leimataan, mikä on todennäköinen proteiinin sitoutumiskohta. Ihanteellinen amplikonin koko on tässä tapauksessa 50-200 emästä .
2. Kiinnostava proteiini lisätään, kun taas osa DNA:sta jätetään koskemattomaksi myöhempää vertailua varten.
3. Lisätään leikkausainetta - kemiallista tai entsymaattista . Leikkausaine aiheuttaa satunnaisesti taukoja DNA:han. Reaktio-olosuhteet valitaan siten, että jokainen DNA-juoste leikataan vain yhdestä kohdasta. Proteiini, joka sitoutuu spesifisesti DNA-nukleotidisekvenssiin, suojaa sitoutumiskohtaa katkeamiselta.
4. DNA:n hajoamistuotteet erotetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla . DNA-fragmentit, jotka eivät ole sitoutuneet proteiiniin, leikataan satunnaisissa paikoissa ja jaetaan geelissä "tippuina". DNA-fragmentit, joihin proteiini sitoutuu, suojataan leikkaamiselta ja muodostavat jäljen, jäljen ( englanniksi  jalanjälki ) sellaisiin "tikkaita". Samanaikaisesti jalanjälkien kanssa DNA-sekvensointi voidaan suorittaa Maxam-Gilbert-menetelmällä ja määritetään nukleotidisekvenssi, johon vastaava proteiini sitoutuu.

Merkintä

Analysoidut DNA-molekyylit proteiinin sitoutumiskohdan sijainnin määrittämiseksi voidaan leimata erikseen 3'- ja 5'-päästä. Tunnisteita käytetään:

• Radioaktiivisia leimoja käytetään perinteisesti DNA-fragmenttien leimaamiseen jalanjälkiä varten, tämä leimausmenetelmä kehitettiin Maxam-Gilbertin DNA-sekvensointimenetelmille . Tämä variantti on erittäin herkkä; pieniä määriä DNA:ta voidaan visualisoida radioaktiivisella leimalla.
• Fluoresoivat etiketit korvaavat vaarallisia radioaktiivisia aineita. Fluoresoiva leimaus on kuitenkin vähemmän herkkä DNA-kuvaukselle, eikä jalanjälkituotteiden pieniä pitoisuuksia voida havaita. Sekvensointigeelejä ja kapillaarielektroforeesitekniikoita käytetään fluoroforeilla merkittyjen tuotteiden visualisointiin . [3]

Leikkausaine

Katkaisuaineena tutkitun DNA:n hajottamiseksi käytetään tyypin I DNaasia [3] [4] , Fentonin reagenssia [5] , ultraviolettisäteilyä [ 6] .

Muistiinpanot

1. ↑ Solun molekyylibiologia. M.: Mir, 1994.
2. ↑ Galas D ja Schmitz A. (1978) DNAase footprinting: yksinkertainen menetelmä proteiini-DNA:n sitoutumisspesifisyyden havaitsemiseksi. Nukleiinihappotutkimus. 5(9):3157-70.
3. ↑ 1 2 3 Hampshire A, Rusling D, Broughton-Head V ja Fox K. (2007) Footprinting: Menetelmä DNA:ta sitovien ligandien sekvenssiselektiivisyyden, affiniteetin ja kinetiikan määrittämiseksi. menetelmiä. 42:128-140.
4. ↑ LeBlanc B ja Moss T. (2001) DNase I Footprinting. Molekyylibiologian menetelmät. 148:31-8.
5. ↑ Zaychikov E, Schickor P, Denissova L ja Heumann H. (2001) Hydroxyl radical footprinting. Molekyylibiologian menetelmät. 148:49-61.
6. ↑ Geiselmann J ja Boccard F. (2001) Ultraviolet-laser footprinting. Molekyylibiologian menetelmät. 148:161-73.