Ionipuolijohdesekvenssi ( eng. Ion Semiconductor Sequencing ) on menetelmä DNA-sekvenssin määrittämiseksi, joka perustuu DNA-polymeroinnin aikana vapautuvien vetyionien havaitsemiseen. Tämä on "sekvensointi-synteesi" -tekniikka, jossa komplementaarinen juoste konstruoidaan templaattijuosteen sekvenssistä.
Mikrokuopat, jotka sisältävät sekvensoitavan templaatti-DNA-molekyylin, ladataan yhden tyyppisellä deoksiribonukleotiditrifosfaatilla (dNTP). Jos lisätty dNTP on komplementaarinen templaatin johtavalle nukleotidille, se sisältyy kasvavaan komplementaariseen juosteeseen. Tämä aiheuttaa vetyionien vapautumisen, mikä laukaisee ISFET -ionianturin , joka osoittaa, että reaktio on tapahtunut. Jos templaattiketjun sekvenssissä on yhden nukleotidin toisto, useita dNTP-molekyylejä kiinnittyy yhdessä syklissä. Tämä johtaa muodostuneiden vetyionien määrän kasvuun ja suhteellisesti korkeampaan sähköiseen signaaliin.
Tämä tekniikka eroaa muista sekvensointitekniikoista siinä, että se ei käytä modifioituja nukleotideja ja optisia antureita. Ionipuolijohdesekvensointia voidaan kutsua myös ionivirtasekvenssiksi, pH-välitteiseksi sekvensoinniksi tai puolijohdesekvensoinniksi. Ion Torrent Systems, Inc:n kehittämä teknologia on lisensoitu DNA Electronics Ltd:ltä [1] [2] ja julkaistiin helmikuussa 2010. [3] Ion Torrent sijoitti järjestelmänsä nopeiksi, kompakteiksi ja taloudellisiksi sekvenssereiksi, jotka soveltuvat moniin laboratorioihin kuin ammattijärjestelmiin. [4] Rochen 454 Life Sciences tekee yhteistyötä DNA Electronicsin kanssa kehittääkseen tätä tekniikkaa käyttävän kompaktin, pitkän sekvenssin lukutavan DNA-alustan. [5]
Deoksiribonukleotiditrifosfaatin (dNTP) liittyminen kasvavaan DNA-ketjuun tapahtuu kovalenttisen sidoksen muodostumisen ja pyrofosfaatin ja positiivisesti varautuneen vetyionin vapautumisen myötä. [1] [3] [6] dNTP sisällytetään vain, jos se on komplementaarinen templaattijuosteen johtavan parittoman nukleotidin kanssa. Ionipuolijohteiden sekvensointi perustuu siihen, että kun yhden tyyppinen dNTP korvataan toisella, vetyioni vapautuu.
Modifioimattomat A-, C-, G- tai T - dNTP :t täytetään peräkkäin jokaiseen mikrokuoppaan puolijohdesirulle , joka sisältää yhden sekvensoitavan yksijuosteisen DNA-templaattimolekyylin ja DNA-polymeraasin . [3] [7] [8] Jos lisätty dNTP on komplementaarinen seuraavan parittoman nukleotidin kanssa templaattijuosteessa, se liitetään kasvavaan komplementaariseen juosteeseen DNA-polymeraasin avulla. [9] Jos lisätty dNTP ei ole komplementaarinen, polymerointireaktiota ei tapahdu. Reaktiossa vapautuva vetyioni muuttaa liuoksen pH :ta, jonka ISFET havaitsee . [1] [3] [7] Reagoimattomat dNTP-molekyylit pestään pois ennen seuraavaa sykliä, kun muita dNTP-lajeja lisätään. [7]
ISFET - anturit sijaitsevat mikrokuoppien ioniherkän kerroksen alla . [4] Kaikki kerrokset on sijoitettu CMOS-sirulle, joka on samanlainen kuin elektroniikkateollisuudessa yleisesti käytetyt kerrokset. [4] [10]
Jokainen siru sisältää joukon mikrokuoppia vastaavilla ISFET - antureilla. [7] Jokainen emittoitunut vetyioni laukaisee ISFET - anturin. Sirulta tietokoneelle siirrettyjen sähköisten impulssien sarja muunnetaan DNA-sekvenssiksi ilman välisignaalin muuntamista, [7] [11] koska elektroniikka rekisteröi suoraan nukleotidien sulkeumien tapahtumat ketjussa ilman leimattuja nukleotideja ja optisia mitat. [4] [10] Signaalinkäsittely ja DNA-sekvenssien kokoaminen voidaan tehdä ohjelmistolla.
Ionipuolijohdesekvensoinnin tarkkuus helmikuussa 2011 oli 99,6 % 50 nukleotidin fragmentilla (luettu), 100 Mb kulkua kohti. [12] Helmikuussa 2011 sekvensoitujen fragmenttien pituus oli 100 emäsparia. [12] 5 nukleotidin pituisten toistojen lukutarkkuus oli 98 %. [12] Näitä tietoja ei ole vielä riippumattomasti varmennettu yrityksen ulkopuolella.
Ionipuolijohdesekvensoinnin tärkeimmät edut ovat suuri sekvensointinopeus alhaisilla alkuinvestoinneilla ja käyttökustannuksilla. [8] [11] Tämän teki mahdolliseksi modifioitujen nukleotidien ja optisten mittausten puuttuminen.
Koska järjestelmä tallentaa luonnollisen polymeraasin tekemien nukleotidien lisäystapahtumat, sekvensointi voi tapahtua reaaliajassa. Itse asiassa sekvensoinnin nopeutta rajoittaa nukleotidisubstraatin muutosnopeus . [13] Teknologian kehittäjä Ion Torrent Systems väittää, että kunkin nukleotidin lisäyksen mittaus (kiinnitys) kestää 4 sekuntia ja jokainen ajo kestää noin tunnin, jonka aikana sekvensoidaan 100-200 nukleotidin sekvenssi. [11] [14] Edistys puolijohdesirujen alalla (ennustettu Mooren lain mukaan) viittaa siihen, että lukujen lukumäärää sirua kohti (ja siten ajoa kohti) pitäisi lisätä. [yksitoista]
Ion Torrent Systems, Inc:n pH-välitteisen sekvensserin hankintahinta oli lanseerauksen yhteydessä noin 50 000 dollaria, ei sisällä näytteenkäsittelylaitteita ja palvelinta tietojen analysointia varten. [8] [11] [14] Kustannukset ajoa kohti ovat myös huomattavasti alhaisemmat kuin vaihtoehtoiset automatisoidut sekvensointimenetelmät, noin 1 000 dollaria. [8] [12]
Jos templaattijuosteessa (sekvensoitavassa) on homopolymeeri, joka koostuu saman nukleotidin toistoista (esim. GGGGG) , kiinnittyy useita nukleotideja kerralla ja yhdessä syklissä muodostuu lisää vetyioneja. Tämä johtaa suurempaan pH-muutokseen ja suhteellisesti korkeampaan elektroniseen signaaliin. [11] Tämän järjestelmän rajoituksena on, että toiston pituuden laskeminen on vaikeaa. Tämä rajoitus on yhteinen muille menetelmille, jotka havaitsevat yksittäisiä nukleotideja, kuten pyrosekvensointi . [15] Pitkän toiston synnyttämiä signaaleja on vaikea erottaa samanlaisista muun pituisista, esimerkiksi 7 nukleotidin pituista toistoa on vaikea erottaa 8 nukleotidin pituisesta homotoistosta.
Sekvensointivirheitä oli myös merkittävässä määrin yksittäisten nukleotidien insertioiden ja deleetioiden muodossa, yleensä heterotsygoottisessa tilassa. Tämän ongelman ratkaisemiseksi Life Technologies on julkaissut päivityksen Ion Reporter -ohjelmistotuotteeseen.
Toinen tämän järjestelmän haittapuoli on lyhyt lukupituus verrattuna muihin sekvensointimenetelmiin, kuten Sanger-sekvensointiin tai pyrosekvensointiin . Suuret lukufragmenttipituudet ovat hyödyllisiä de novo - genomin kokoamisessa . Tähän mennessä Ion Torrent Systems, Inc:n saavuttama lukupituus on 600 emäsparia kulkua kohti. [3] [8] Tällä hetkellä suorituskyky on alhaisempi kuin muilla korkean suorituskyvyn sekvensointitekniikoilla, vaikka kehittäjät toivovatkin voivansa muuttaa tätä lisäämällä mikrokuoppien tiheyttä sirua kohti . [3] Vuonna 2018 julkaistiin uusi sekvensserisarja Ion GeneStudio S5, joka on suorituskyvyltään verrattavissa muihin koko genomin sekvensointitekniikoihin, mutta ylittää ne nopeudeltaan.
Ionipuolijohdesekvensointi sijoittuu markkinoille nopeaksi, kompaktiksi ja taloudelliseksi sekvensointikoneeksi, jota voidaan käyttää monissa laboratorioissa huippuluokan koneena. [3] [4] Yritys toivoo, että niiden järjestelmää käytettäisiin erikoiskeskusten lisäksi myös sairaaloissa ja pienissä yliopisto- ja teollisuuslaboratorioissa. Tammikuussa 2011 julkaistu New York Timesin artikkeli "Taking DNA Sequencing to the Masses" korostaa tätä tavoitetta. [16]
Koska vaihtoehtoisilla sekvensointimenetelmillä voidaan saavuttaa pidempiä lukupituuksia (ja siksi ne sopivat paremmin koko genomin analysointiin ), tämä tekniikka voi olla sopivin pienimuotoisiin sovelluksiin, kuten mikrobien genomin sekvensointiin, mikrobien transkriptiosekvenssiin , kohdesekvensointiin, amplikonisekvensointiin tai kirjastojen sekvenssien laaduntarkastuksia varten. [3] [8]