Kryoelektronimikroskoopia ( cryo-EM , eng. cryo-EM ) tai elektronikryomikroskopia on eräänlainen siirtomuoto elektronimikroskopia ( TEM , eng. TEM ) , jossa näyte on tutkitaan kryogeenisissä lämpötiloissa (yleensä nestetypessä ). CryoEM on saamassa suosiota rakennebiologiassa , koska se mahdollistaa näytteiden, joita ei ole värjätty tai muuten kiinnitetty, tarkkailuun ja näyttää ne alkuperäisessä ympäristössään. Tämä on toisin kuin röntgenkristallografia , joka vaatii näytteen kiteyttämistä , mikä voi olla vaikeaa, ja sijoittamista ei-fysiologisiin ympäristöihin, mikä voi joskus johtaa toiminnallisesti sopimattomiin konformaatiomuutoksiin.
Kryo-EM-karttojen resoluutio on parantunut tasaisesti, ja vuonna 2014 saatiin lähes atomiresoluutioisia rakenteita, kuten viruksia , ribosomeja , mitokondrioita , ionikanavia ja entsyymikomplekseja, yhteensä 170 kD 4,5 Å:n resoluutiolla. Bridget Carragher ja hänen kollegansa Scripps National Resource for Automated Molecular Microscopysta käyttivät hänen ja Clint Potterin kehittämiä menetelmiä luodakseen ensimmäisen sub-3 angströmin kryoelektronimikroskoopin kuvantamisen rakennebiologiassa , mikä nosti kryo-EM:n profiilia. työkalu, joka on nyt verrattavissa ja mahdollisesti parempi kuin tavanomaiset röntgenkristallografiamenetelmät. Kesäkuussa 2015 julkaistiin 2,2 A:n kartta bakteerientsyymistä beeta-galaktosidaasi . Elektronikryomikroskopian versio on kryoelektronitomografia (CET), jossa näytteestä luodaan 3D-rekonstruktio 2D-kaltevalla kuvalla.
Vuoden 2017 kemian Nobel-palkinto myönnettiin Jacques Dubochetille , Joachim Frankille ja Richard Hendersonille "kryoelektronimikroskoopin kehittämisestä biomolekyylien korkearesoluutioiseen rakenteen määritykseen liuoksessa" [1] [2] [3] .
Aluksi kryoelektronimikroskoopia oli tarkoitettu käytettäväksi keinona torjua biologisten näytteiden säteilyvaurioita. Säteilymäärä, joka tarvitaan näytteen kuvan keräämiseen elektronimikroskoopissa, on riittävän suuri ollakseen mahdollinen näytevaurion lähde herkille rakenteille. Lisäksi elektronimikroskooppikolonnin vaatima suuri tyhjiö tekee näyteympäristöstä varsin ankaran.
Tyhjiöongelma ratkaistiin osittain ottamalla käyttöön negatiivinen värjäys , mutta senkin avulla biologiset näytteet joutuivat rakenteelliseen romahtamiseen, kun näyte dehydratoitiin . Mahdollisuutta upottaa näytteitä jäähän sublimaatiolämpötilan alapuolelle pohdittiin jo varhain, mutta jäätyessään vesi pyrkii asettumaan vähemmän tiheäksi kidehilaksi, mikä voi tuhota kaiken siihen rakennetun rakenteen.
1980-luvun alussa useat kiinteän olomuodon fysiikan ryhmät yrittivät tuottaa lasimaista jäätä eri tavoilla, kuten korkeapainejäädytyksellä tai pikajäädytyksellä. Alkuperäisessä vuoden 1984 paperissa Jacques Dubochet'n johtama ryhmä European Molecular Biology Laboratoryssa osoitti kuvia adenoviruksesta , joka oli upotettu lasitettuun vesikerrokseen. Tätä artikkelia pidetään yleisesti kryoelektronimikroskoopin alkuperänä, ja tekniikkaa on kehitetty niin, että siitä on tullut standardi monissa laboratorioissa ympäri maailmaa.
Kuvan tuottamiseen käytettyjen elektronien energia (80-300 kV) on riittävän korkea katkaisemaan kovalenttiset sidokset. Kuvattaessa näytteitä, jotka ovat herkkiä säteilyvaurioille, on tarpeen rajoittaa kuvan saamiseen käytettyä elektronialtistusta. Nämä matalat valotukset vaativat tuhansien tai jopa miljoonien identtisten jäädytettyjen molekyylien kuvien valinnan, kohdistamisen ja keskiarvon laskemisen korkearesoluutioisten karttojen tuottamiseksi erikoisohjelmistojen avulla. Merkittävä parannus rakenteellisissa ominaisuuksissa saavutettiin vuonna 2012 ottamalla käyttöön suorat elektroniilmaisimet ja parempia laskenta-algoritmeja.
Ohut filmi
Biologinen materiaali levitetään elektronimikroskooppiverkon päälle ja pidetään jäädytetyssä hydratoituneessa tilassa nopealla pakastuksella, yleensä nestemäisessä etaanissa nestemäisen typen lämpötilassa. Pitämällä näytteet nestemäisen typen lämpötilassa tai kylmemmässä, ne voidaan viedä elektronimikroskoopin kolonnin suurtyhjiötilaan. Useimmat biologiset näytteet ovat äärimmäisen herkkiä säteilylle, joten ne on kuvattava pienillä annoksilla (apua on, että kryoelektronimikroskoopin alhainen lämpötila tarjoaa lisäsuojatekijän säteilyvaurioita vastaan).
Siksi kuvat ovat erittäin meluisia. Joissakin biologisissa järjestelmissä kuvien keskiarvo voidaan laskea signaali-kohinasuhteen lisäämiseksi ja näytteen korkearesoluutioisen tiedon poimimiseksi käyttämällä tekniikkaa, joka tunnetaan nimellä yksittäisen hiukkasen analyysi. Tämä lähestymistapa vaatii yleensä, että keskiarvot ovat identtisiä, vaikkakin nyt voidaan tutkia rajoitettua konformationaalista heterogeenisyyttä (esim. ribosomi). Proteiinikompleksien ja virusten kryo-EM-kuvista saadut 3D-rekonstruktiot on ratkaistu subnanometrin tai lähes atomin resoluutioon, mikä tarjoaa uusia näkemyksiä näiden suurten kokoonpanojen rakenteesta ja biologiasta.
Järjestettyjen proteiiniryhmien, kuten transmembraanisten proteiinien kaksiulotteisten kiteiden tai kierteisten proteiiniryhmien, analyysi mahdollistaa myös keskiarvon laskemisen, mikä voi tarjota korkean resoluution tietoa näytteestä. Tätä menetelmää kutsutaan elektronikristallografiaksi.
lasiainen osa
Ohutkalvomenetelmä rajoittuu ohuisiin näytteisiin (tyypillisesti <500 nm), koska elektronit eivät voi ylittää paksumpia näytteitä ilman useita sirontatapahtumia. Paksummat näytteet voidaan lasittaa upottamalla (kryofiksaatiolla) etaaniin (jopa kymmeniä µm paksuja) tai yleisemmin korkeapainejäädytyksellä (jopa satoja µm). Ne voidaan sitten leikata ohuiksi osiksi (40–200 nm) timanttiveitsellä kryotramikrotomessa alle -135 °C:n lämpötiloissa (devitrifikaatiolämpötila). Poikkileikkaukset kerätään elektronimikroskooppiruudukkoon ja esitetään samalla tavalla kuin ohueksi kalvoksi lasitettu näyte. Tätä tekniikkaa kutsutaan lasiaisleikkeiden kryoelektronimikroskoopiksi (CEMOVIS) tai jäädytettyjen hydratoitujen leikkeiden kryoelektronimikroskoopiksi.
Lasittujen biologisten näytteiden visualisoinnin lisäksi kryo-EM:llä voidaan myös kuvata näytteitä sellaisista materiaaleista, jotka ovat liian haihtuvia tyhjiössä kuvantamiseen tavallisella huoneenlämpöisellä elektronimikroskopialla. Esimerkiksi lasitettuja neste-kiintoainerajapintoja voidaan uuttaa kryo-EM-analyysiä varten, ja rikki, joka on alttiina sublimaatiolle elektronimikroskooppien tyhjiössä, voidaan stabiloida ja kuvata kryo-EM:ssä [4] [5] .
Kryoelektronimikroskoopissa voidaan käyttää monia menetelmiä. Suosituimmat menetelmät: