Kryoelektronitomografia

Elektroninen kryotomografia  ( ECT , myös   kryoelektronitomografia, cryo-ET tai CET ) on korkearesoluutioinen (~4 nm) kolmiulotteinen kuvantamistekniikka. Käytetään kuvien saamiseksi biologisista makromolekyyleistä ja soluista [1] .

ECT:tä käytetään  transmissioelektronimikroskoopin (TEM) kanssa, jossa näytteet kallistetaan eri kulmiin elektronisuihkua vastaan, jolloin saadaan sarja kaksiulotteisia kuvia. Sarja 2D-kaltevia kuvia käsitellään tietokoneella, jolloin saadaan 3D-tomogrammi.

Toisin kuin  elektronitomografiaa käyttävissä tekniikoissa, tässä tekniikassa tutkittavat näytteet pakastetaan erityisellä tekniikalla, jotta jääkiteet, paine, kemikaalit tai muut tekijät eivät vahingoita tutkimuskohdetta. Tätä menettelyä kutsutaan kryofiksaatioksi. Yleensä orgaaninen näyte jäähdytetään siten, että muodostuva jää on amorfista (ei-kiteistä, joten tehdään lasitusta) [2] ja läpivalaisu suoritetaan kryogeenisissa olosuhteissa alle °C:n lämpötiloissa, mikä estää biologisten rakenteiden tuhoutumisen. [3] .

Tekniikan kuvaus

Elektronimikroskopiassa ( EM ) näytteet ovat korkeassa tyhjiössä. Tällaista tyhjiötä ei voida soveltaa biologisiin näytteisiin, koska vesi kiehuu soluissa ja ne räjähtävät. Huoneenlämmössä EM:ssä näytteet kuivataan. Toinen lähestymistapa biologisten näytteiden stabilointiin on niiden jäädyttäminen ( kryoelektronimikroskooppi ). Kryoelektronimikroskoopissa näytteet (yleensä pieniä soluja (kuten bakteerit tai Archaea ) tai virukset ) valmistetaan tutkittavaksi normaaleissa vesipitoisissa väliaineissa. Näytteet upotetaan kryogeeniin (yleensä nestemäiseen etaaniin ), kun taas vesimolekyylillä ei ole aikaa järjestyä uudelleen kidehilaksi. Tällaisen jäähdytyksen seurauksena vesi siirtyy amorfisen jään tilaan. [2] Tämä säilyttää solurakenteet, kuten lipidikalvot, jotka tavallisesti tuhoutuvat tavanomaisessa jäädytyksessä. Jäädytetyt näytteet säilytetään  nestemäisen typen lämpötilassa , eikä vettä lämmitetä tarpeeksi kiteytymään.

Näytteitä tarkastellaan transmissioelektronimikroskoopissa (TEM). Niitä kallistetaan eri kulmissa suhteessa elektronisäteeseen (tyypillisesti 1 tai 2 asteen välein noin -60° - +60°) kuvien tuottamiseksi kussakin kulmassa. Kuvasarja käsitellään tietokoneella ja saadaan kolmiulotteinen kuva kiinnostavasta kohteesta [4] . Tuloksena olevaa kuvaa kutsutaan tomogrammiksi tai tomografiseksi rekonstruktioksi.

Ominaisuudet

Transmissioelektronimikroskoopissa (TEM ) elektronit ovat vuorovaikutuksessa näytemateriaalin kanssa, joten sen paksuus rajoittaa resoluutiota. Näytteiden tulee olla vähintään ~500 nm paksuja saavuttaakseen "makromolekyylisen" resoluution (~4 nm). Tästä syystä useimmat ECT-tutkimukset ovat keskittyneet puhdistettujen makromolekyylikompleksien, virusten ja pienten solujen, kuten monien bakteerilajien ja Archaean , tutkimukseen .

Elektronien voimakas vuorovaikutus aineen kanssa johtaa anisotropiavaikutuksiin. Kun näytettä kallistetaan, elektronisuihku on vuorovaikutuksessa suhteellisen suuren poikkileikkausalueen kanssa. Tämä johtaa siihen, että käytännössä yli 60-70° kallistuskulmat eivät anna paljon tietoa, joten niitä ei käytetä.

ECT käyttää myös kryofluoresenssimikroskopiaa [5] , valomikroskopiaa (esim. cryo-Palm [6] ) ja muita tekniikoita. Näissä tekniikoissa näyte, joka sisältää fluoresoivasti leimatun proteiinin, jäädytetään ja sitä tarkastellaan valomikroskoopilla. Tässä tapauksessa näyte on säilytettävä lämpötilassa (alle -150 °C). Fluoresoiva signaali tunnistetaan ja näyte siirretään kryo-ET:hen tutkittavaksi.

Katso myös

Muistiinpanot

  1. ↑ Gan, Lu; Jensen, Grant J. Solujen elektronitomografia  (määrätön)  // Quarterly Reviews of Biophysics. - 2012. - 1. helmikuuta ( osa 45 , nro 1 ). - S. 27-56 . — ISSN 1469-8994 . - doi : 10.1017/S0033583511000102 . — PMID 22082691 .
  2. ↑ 1 2 Arkistoitu kopio . Haettu 8. lokakuuta 2017. Arkistoitu alkuperäisestä 8. lokakuuta 2017.
  3. ↑ Dubochet, J.; Adrian, M.; Chang, JJ; Homo, JC; Lepault, J.; McDowall, A.W.; Schultz, P. Kryoelektronimikroskooppi lasitetuista näytteistä  (neopr.)  // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1988. - 1. toukokuuta ( osa 21 , nro 2 ). - S. 129-228 . — ISSN 0033-5835 . - doi : 10.1017/s0033583500004297 . — PMID 3043536 .
  4. ↑ Lucič, Vladan; Rigort, Aleksanteri; Baumeister, Wolfgang. Kryoelektronitomografia: rakennebiologian tekemisen haaste in situ  // The  Journal of Cell Biology : päiväkirja. - 2013. - 5. elokuuta ( nide 202 , nro 3 ). - s. 407-419 . - ISSN 1540-8140 . - doi : 10.1083/jcb.201304193 . — PMID 23918936 .
  5. ↑ Zhang, Peijun. Korrelatiivinen kryoelektronitomografia ja solujen optinen mikroskopia  (englanniksi)  // Current Opinion in Structural Biology : Journal. - 2013. - 1. lokakuuta ( nide 23 , nro 5 ). - s. 763-770 . — ISSN 1879-033X . - doi : 10.1016/j.sbi.2013.07.017 . — PMID 23962486 .
  6. ↑ Chang, Yi-Wei. Korreloitu kryogeeninen fotoaktivoitu lokalisointimikroskopia ja kryoelektronitomografia  (englanniksi)  // Nature Methods  : Journal. - 2014. - 1. heinäkuuta ( osa 11 , nro 7 ). - s. 737-739 . — ISSN 1548-7105 . - doi : 10.1038/nmeth.2961 . — PMID 24813625 .

Ulkoiset linkit