Paikallisen potentiaalin kiinnitysmenetelmä , patch-clamp ( eng. patch - fragment, clamp here - fixation) on sähköfysiologinen tekniikka ionikanavien ominaisuuksien tutkimiseen , joka koostuu siitä, että solukalvon fragmentti eristetään erityisellä mikropipetti. Tämän tekniikan avulla kokeilija voi hallita potentiaalieroa kalvon sivujen välillä sekä sijoittaa sen ympäristöön, jolla on tietty kemiallinen koostumus. Näissä hyvin kontrolloiduissa olosuhteissa mitataan kalvon läpi kulkevia ionivirtoja, mikä johtaa viime kädessä johtopäätöksiin siitä, kuinka ionikanavat reagoivat sähköiseen ja kemialliseen stimulaatioon. Menetelmä on niin herkkä, että sen avulla voidaan tarkkailla kalvon kanssa vuorovaikutuksessa olevien yksittäisten molekyylien käyttäytymistä ja kemiallisia muutoksia. [1] Ionikanavien ominaisuuksien mittaamiseksi optimaalisella tavalla on kehitetty kokeellisia protokollia. Tämän tekniikan kehittäneet saksalaiset tutkijat Erwin Neher ja Bert Sakmann saivat Nobel-palkinnon vuonna 1991.
Elävät solut on peitetty kalvolla , jonka rakenteellinen perusta on kaksinkertainen lipidien kerros, joka on hieman vettä läpäisevä ja käytännössä ioneja läpäisemätön. Jokaisen solun on vaihdettava erilaisia aineita ja erityisesti ioneja ulkoisen ympäristön kanssa. Ionien kuljetuksella kalvon läpi on tärkeä rooli solun viritys- ja signaalinsiirtoprosesseissa. Ionit tulevat soluun ja poistuvat siitä kalvoon rakennettujen proteiinirakenteiden – kanavien ja kuljettajien kautta [2]
Kuljettajat ovat kalvoproteiineja , jotka sitoutuvat kuljetettuun aineeseen kalvon toisella puolella, kuljettavat tämän aineen kalvon läpi ja vapauttavat sen sitten. Tällainen siirto tulee mahdolliseksi, koska aineen kanssa kytkeytymisen seurauksena kuljettaja muuttaa konformaatiota (eli muotoa, suuntausta). Tärkein kuljettaja eukaryoottisoluissa on natrium- kaliumpumppu . Jotta tämä pumppu toimisi, tarvitaan energiaa, jonka se saa soluun varastoidusta ATP :stä . Yhden toimintajaksonsa aikana pumppu poistaa 3 Na + -ionia kennosta ja syöttää siihen 2 K + -ionia . Yksi tämän kuljettajan molekyyli tekee noin 10³ sykliä sekunnissa. Samanlainen jaksotiheys on tyypillistä muun tyyppisille kuljettimille [3] .
Kanavat ovat proteiineja , jotka toimivat kalvon huokosina, koska ne muodostavat aukkoja, joiden läpi ionit voivat kulkea. Kalvokanavat ovat selektiivisiä - läpäiseviä vain tietyille aineille. Selektiivisyys johtuu huokossäteestä ja varautuneiden funktionaalisten ryhmien jakautumisesta niissä. On kanavia, jotka läpäisevät selektiivisesti natriumioneja (natriumkanavat), sekä kalium-, kalsium- ja kloridikanavia. Jokaiselle ionityypille ei ole yhtä, vaan melko monta kanavatyyppiä [4] . 10 6 - 10 7 ionia kulkee yhden kanavan läpi sekunnissa [3] .
Huolimatta perustavanlaatuisista eroista kanavien ja kuljettajien kautta tapahtuvan kuljetuksen mekanismissa, ne voivat muodostua erittäin homologisista proteiineista. Joten äskettäin saatu tieto siitä, että yhden aminohapon mutaatio kaksiarvoisen metallin kuljettajan DMT1 proteiinissa johtaa sen muuttumiseen kalsiumkanavaksi . Lisäksi on olemassa ainakin yksi kuljettaja (erytrosyyttikloridi-bikarbonaatti-vaihdin), joka suorittaa 10 5 siirtoa sekunnissa [3] , mikä on hyvin lähellä kanaville ominaisia nopeuksia ja viittaa jonkin "väliaineen" olemassaoloon. kanavat ja mekanismikuljettimet.
Koska ionit ovat sähköisesti varautuneita molekyylejä, kalvokanavien läpi kulkeutuessaan myös varaus siirtyy, mikä tarkoittaa, että kalvon läpi kulkee sähkövirta. Tämä virta voidaan mitata. Mitä suurempi potentiaaliero kalvon sivujen välillä on, sitä suurempi on virta. Yhden kanavan johtavuus (virran suhde potentiaalieroon) avoimessa tilassa vaihtelee kanavan tyypistä riippuen 4–5 ( CFTR :ssä [5] ja ENaC [6] ) 30–50:een (esim. nikotiiniherkkä kolinerginen reseptori [7] ) picosiemens . Tämä tarkoittaa, että 100 mV:n potentiaalierolla kanavan läpi kulkee usean pikoampeerin virta.
Solukalvojen sähköilmiöitä voidaan mitata käyttämällä teräviä lasimikroelektrodeja , jotka työnnetään soluun. Yhden intrasellulaarisen elektrodin tekniikka mahdollistaa potentiaalieron mittaamisen kiinteällä virralla. Harvemmin tällä tekniikalla voidaan mitata virtaa kiinteässä potentiaalissa käyttämällä kytkentäpuristintekniikkaa. Kaikki mittaukset tapahtuvat yksinomaan koko solussa, jolloin tutkitaan koko solukalvon sähköisiä ominaisuuksia.
Se tosiasia, että transmembraanipotentiaalin kiinnittäminen mahdollistaa kalvon johtavuuden mittaamisen virran muutoksista vakiojännitteellä, havaittiin ensimmäisen kerran 1940-luvulla. XX vuosisadalla, ja pian englantilaiset tutkijat Alan Hodgkin ja Andrew Huxley ( Alan Hodgkin ja Andrew Huxley ) aloittivat kokeita kahden elektrodin potentiaalipuristimella (2-elektrodin jännitepuristin). [8] Menetelmän ydin on seuraava. Kaksi elektrodia asetetaan kennoon, yksi - vertailuelektrodi - jää kennon ulkopuolelle. Ensimmäinen solunsisäinen elektrodi toimii transmembraanisen potentiaalieron (eli sen ja vertailuelektrodin välisen potentiaalieron) mittaamisessa, toinen voi syöttää virtaa. Ei ole mahdollista käyttää samaa terävää elektrodia virransyötön ja potentiaalieron mittaamiseen. Tosiasia on, että tällaisen elektrodin tulosähkövastus on suuruusluokkaa 100-200 MΩ, mikä on verrattavissa solukalvon resistanssiin, joten jos virta kulkee "elektrodi-kenno" -järjestelmän läpi, jännitehäviö elektrodilla on oikeassa suhteessa itse kalvon jännitehäviöön, eikä näitä kahta osaa voida erottaa toisistaan [8] . Lisäksi erityinen laite - signaaligeneraattori - asettaa komentopotentiaalin , jonka tulisi olla yhtä suuri kuin transmembraaninen potentiaali. Mitattu transmembraanipotentiaali syötetään vertailulaitteen tuloon , joka vähentää mitatun potentiaalin komentoarvosta ja syöttää eron suuruudesta riippuen virtaa virtaelektrodille siten, että se kompensoi tämän eron. Virtamonitori puolestaan mittaa jatkuvasti tähän tarvittavan virran määrää. 1940- ja 50-luvuilla, kun Hodgkin ja Huxley työskentelivät, ei ollut mikroelektrodeja, joten ohuita lankoja käytettiin solunsisäisinä elektrodeina. Tämä määritti kohteen valinnan - halkaisijaltaan 1 mm:n jättimäinen kalmari aksoni, johon nämä johdot työnnettiin. Tällä objektilla tutkijat suorittivat kahden elektrodin potentiaalin kiinnitysmenetelmää käyttäen kokeita, joissa todettiin toimintapotentiaalin ioninen luonne ja ensin oletettiin ionikanavien olemassaoloa (Nobel-palkinto vuonna 1963 , jaettu J. Ecclesin kanssa , joka sai sen synaptisen siirron alan tutkimukseen). Kahden elektrodin potentiaalikiinnitys on käytössä vielä tänäkin päivänä teräviä lasimikroelektrodeja käyttäen, mutta jopa niiden kanssa tällä tekniikalla on merkittäviä rajoituksia: kaksi elektrodia voidaan työntää vain erittäin suureen soluun (esimerkiksi sammakon munasoluun).
XX vuosisadan 70-luvun lopulla. Erwin Neher (E.Neher) ja Bert Sakman (B.Sakmann) havaitsivat, että kartiomaiset lasipipetit, joiden kärjen halkaisija on 1-2 mikronia, voivat muodostaa kontakteja solukalvoon (kalvo-lasiraja) useiden gigaohmien resistanssilla. - tämä on niin kutsuttu gigaohmikontakti . Sen avulla voit eristää pipetin sisällä olevan fragmentin ulkoisesta ympäristöstä ja muusta kalvosta. Pipetillä rajattua kalvon fragmenttia kutsutaan patch - "fragmentiksi", menetelmän nimessä oleva sana clamp (kiinnitys) voidaan tulkita sekä tämän fragmentin sieppaamiseksi ja eristämiseksi että transmembraanisen potentiaalin kiinnittymiseksi eristetty fragmentti tai, kuten myöhemmin kuvataan, koko solun potentiaali tai virta. [9] Hopea-kloorielektrodi asetetaan elektrolyyttiliuoksella täytettyyn pipettiin, toinen elektrodi sijoitetaan solunulkoisesti pesunesteeseen. Sähköpiiri eroaa aiemmin kuvatusta kahden elektrodin kiinnittämisestä siinä, että samaa elektrodia käytetään sekä potentiaalieron mittaamiseen että virran syöttämiseen, mikä on mahdollista pipetin suhteellisen alhaisen resistanssin vuoksi.
Kuvassa 1 on osa tällaisesta kokoonpanosta.
Valtava pallo, josta osa näkyy näytöllä kuvan keskellä, on solu (sammakon Xenopus laevis oosyytti ), joka on tällä hetkellä mikroskooppivaiheessa, siihen on liitetty patch pipetti, sen halkaisija nenässä on noin 3 mikronia. Gigaohmikontaktin muodostamisen jälkeen se eristää kalvon fragmentin, jonka pinta-ala on noin 7 μm², tämän fragmentin ionikanavien virta voidaan tallentaa.
Juuri kuvattua konfiguraatiota kutsutaan soluun kiinnitetyksi patch-clampiksi (patch-clamp). Se on havainnollistettu kuvassa 2.
Tällä kokoonpanolla on kuitenkin kaksi haittaa.
Ensinnäkin se ei salli riittävän luotettavaa mittausta ja siten transmembraanisen potentiaalieron asettamista, koska molemmat elektrodit, sekä pipetti että ulkoiset, ovat kalvon samalla puolella. Yleisesti ottaen on mahdollista käyttää pesuliuosta, jonka ionikoostumus jäljittelee sytoplasman koostumusta , depolarisoida kalvo pipetin ulkopuolella niin, että ulkoisen elektrodin ja sytoplasman välinen potentiaaliero katoaa ja sitten potentiaaliero elektrodien välillä on yhtä suuri kuin transmembraaninen potentiaali - mutta kaikki tämä on hyvin likimääräistä, koska sytoplasman tarkka koostumus ei ole meille tiedossa.
Toiseksi tämä konfiguraatio ei salli väliaineen koostumusta kontrolloida pipetin ulkopuolella - sytoplasma pysyy siellä, jonka koostumusta ei ole täysin määritetty.
Tietyssä määrin tämä soluihin kiinnitetyn konfiguraation ominaisuus on kuitenkin myös etu: tämä kokoonpano mahdollistaa työskentelyn olosuhteissa, jotka ovat lähimpänä fysiologisia.
Jos pipetti kuitenkin otetaan pois kennosta nopealla liikkeellä, niin "sisäinen" kalvon pala irtoaa kennosta ja saadaan ulospäin konfiguraatio (ulkopuoli sisällä), joka on nimetty sisäpinnan takia. kalvon puoli, yleensä sytoplasmaan päin, on ulkopuolella - pesuliuoksessa ja ulompi on pipetin sisällä. (Kaavio 3.) Vaihtoehtoinen menetelmä siirtymiseksi sisältä ulospäin -konfiguraatioon on seuraava: soluun kiinnitetystä konfiguraatiosta pipetti vedetään tasaisesti, jolloin muodostuu molemmille puolille suljettu vesikkeli; nosta sitten pipetti ilmaan ja laske se toiseen kylpyyn solunsisäisellä liuoksella. Siirron aikana vesikkelin ulompi kalvo tuhoutuu, jolloin muodostuu sisältä ulospäin -konfiguraatio.
Nyt potentiaaliero kalvofragmentin yli on tiukasti sama kuin elektrodien välinen potentiaaliero. On selvää, että tätä modifikaatiota käytettäessä pipetti täytetään liuoksella, joka jäljittelee solunulkoista ympäristöä, kun taas pesuliuos tehdään koostumukseltaan lähelle sytoplasmaa . Samalla pesuliuoksen koostumusta muuttamalla voidaan tutkia, kuinka tällaiset muutokset sytoplasmassa vaikuttavat meitä kiinnostavien kanavien virtaan - pesuliuoshan on kosketuksissa kalvon sytoplasmiseen puoleen) . Samalla tiedämme tarkasti sekä nesteen koostumuksen kalvon molemmilla puolilla että potentiaalieron, jonka avulla voimme tarkasti karakterisoida kanavia käyttämällä Nernstin ja Goldman-Hodgkin-Katzin biofysikaalisia yhtälöitä . Samanaikaisesti, jos yksi kanava joutui kalvon eristettyyn osaan, niin tarkkailemme yksittäisen molekyylin käyttäytymistä ja jos se on ligandin säätelemä kanavareseptori , niin sen vuorovaikutusta muiden yksittäisten molekyylien kanssa.
Jos kokeen olosuhteiden mukaan on tarpeen muuttaa solunulkoisen väliaineen koostumusta , voidaan käyttää koko solukonfiguraatiota . Tällöin pipettiä ei vedetä pois kennosta, vaan siihen kohdistetaan alipaine, jolloin eristetty kalvon fragmentti tuhoutuu.
Sen jälkeen pipetti yhdistetään solunsisäiseen ympäristöön; koska solu on yleensä pieni, niin diffuusion vuoksi sytoplasman koostumus osoittautuu pian identtiseksi pipettiliuoksen koostumuksen kanssa, joten, kuten edellisessä tapauksessa, tiedämme sekä nesteiden koostumuksen että mahdollinen eroavaisuus. Huomaa, että jos sisältä ulospäin -konfiguraatiossa pipettielektrodi oli "solunulkoinen" ja sisäinen elektrodi "solunsisäinen", nyt ne ovat vaihtaneet roolinsa. Kanavien kautta kulkevan virran tutkimuksen kannalta tämän menetelmän etuna on, että solurakenteet ja säätelymekanismit säilyvät tässä. Pienen molekyylipainon omaavat aineet voivat tosin diffundoitua sytoplasmasta pipettiin ja päinvastoin, joten säätelymekanismien täydellistä säilymistä tässä konfiguraatiossa ei voida saavuttaa. Tiettynä konfiguraation haittapuolena voidaan pitää sitä, että mitataan kaikkien kennon kanavien kokonaisvirta, ei yksittäisten kanavien kautta kulkevia virtoja, eli tämän menetelmän resoluutio on pienempi kuin kokoonpanoissa, joissa on repeytynyt kalvo.
Menetelmän pienentyneen resoluution ongelman ratkaisemiseksi ulko-ulos- konfiguraatio (ulkopuoli ulkopuolella) sallii. Jos kokosolutilaan siirtymisen jälkeen pipetti poistetaan hitaasti kennosta, kalvo ei heti irtoa, vaan alkaa venyä putkeen - tämä näkyy kuvassa 5.
Huomaa, että sytoplasman palaset ovat selvästi näkyvissä pipetissä , jotka pääsivät sinne kalvon tuhoutumisen jälkeen siirryttäessä kokosoluun.
Prosessin seuraava vaihe näkyy kuvassa 6.
Kalvoputkesta on tullut hyvin ohut ja lähes näkymätön (solun pinnalla oleva ” ulottuvuus ” on pieni osa kalvoputkeen jääneestä sytoplasmasta ). Seuraavassa hetkessä putki katkeaa ja kalvo sulkeutuu pipetin päälle "käänteisessä" muodossa - huomaamme olevansa "ulkopuolinen" -konfiguraatiossa
Joten pipetti ja sen elektrodi, kuten koko solukonfiguraatio, ovat solunsisäisiä, muutamme vapaasti solunulkoisen liuoksen koostumusta, tutkittavan kalvon pinta-ala on pieni, joten voimme jälleen tutkia yksittäisiä kanavia.
Rei'itetty patch on erityinen muunnelma patch-clampista koko solutilassa. Tässä tapauksessa pipettiliuos sisältää pienen määrän erityistä antibioottia , esimerkiksi amfoterisiini-B :tä tai gramicidiinia . Tämän luokan antibiootit muodostavat ionikanavia solukalvoon mikropipettiin kiinnitettyyn kohtaan .
Tämä lähestymistapa mahdollistaa sen, että solun sisäympäristöä ei korvata pipettielektrodin liuoksella, eli solu pysyy hengissä mahdollisimman vähäisin vaurioin. Näin ollen solun vasteet ärsykkeisiin ovat mahdollisimman lähellä luonnollisia. Samaan aikaan tällä menetelmällä on useita haittoja. Ensinnäkin verrattuna klassiseen kokosolutilaan tulon sähkövastus (joka koostuu pääasiassa pipetin resistanssista ja vastus pipetin ja kalvon liitoskohdassa) on huomattavasti suurempi. Tämä alentaa mahdollisen kiinnityksen laatua, lisää melutasoa tallennuksen aikana ja lisää kaikkien virheiden arvoja, jotka liittyvät koko piirin resistanssin muutoksiin (ulkoisen liuoksen elektrodista pipetissä olevaan elektrodiin). Toiseksi antibiootin vaikutus kestää melko kauan (jopa 30 minuuttia) , mikä lyhentää merkittävästi kokeen käyttöaikaa. Ja kolmanneksi antibiootti vahingoittaa myös kalvoa pipetin kärjen risteyksessä, mikä johtaa gigaohmin kontaktin nopeutuneeseen tuhoutumiseen ja lisäksi lyhentää tehokasta koeaikaa. Näin ollen tätä menetelmän versiota voidaan käyttää menestyksekkäästi vain kokeissa, jotka eivät vaadi pitkää aikaa tutkittavien ilmiöiden tutkimiseen.
Mielenkiintoinen muunnelma patch-clampista on tumattu patch. (Potentiaalin kiinnittäminen solun ytimeen [11] ).
Menetelmä on seuraava. Pipetti tuodaan kennoon ja murtaa sitten nykivästi kalvon läpi. Tämän jälkeen pipetin kärki tuodaan solun ytimeen, pipettiin kohdistetaan pieni alipaine. Tämän seurauksena pipetti tarttuu ytimeen. Sitten pipetti, jonka päässä on ydin, vedetään tasaisesti taaksepäin ja poistetaan häkistä. Pipetti on otettava pois solusta siten, että kalvon poistumispisteessä oleva osa "laittaa" kiinnittyneen ytimen ja katkeaa kietoutuen sen ympärille. Tuloksena on spesifinen versio ulko-ulos-laastaresta, jossa menetelmän tavanomaista versiota suurempi osa kalvosta kiinnitetään pipetin päähän kiedottuna solun ytimen ympärille.
Kun tutkitaan muutoksia samantyyppisten kanavien johtavuudessa vasteena johonkin kemialliseen vaikutukseen tai niiden johtavuuden riippuvuutta kalvon poikki kulkevasta potentiaalierosta, on kätevää kiinnittää potentiaali ja mitata kanavan virta, kuten olemme kuvanneet. niin kaukana. Tätä, yleisintä patch-clamp-tyyppiä, kutsutaan jännitepuristimeksi. Joskus tutkija on kuitenkin kiinnostunut kalvopotentiaalin muutokseen liittyvistä transmembraanisten ionien kuljetusprosesseista - esimerkiksi hermoimpulssin johtamisesta. Tällaisissa tapauksissa voit tehdä päinvastoin: kiinnitä virta vakiotasolle ja tutkia potentiaalieron muutoksia tässä tapauksessa. Tätä vaihtoehtoa kutsutaan virtaliittimeksi (virtakiinnitys).
Glysiinireseptorin yhden kanavan tallennus . Kaksi tilaa on selvästi näkyvissä: suljettu (se vastaa nollavirtaa) ja avoin (se vastaa noin 7 pikoampeerin virtaa). Kanava siirtyy spontaanisti tilasta toiseen ajoittain, välitiloja ei ole. Tallennuksen avulla voit saada kaksi kanavan tärkeintä ominaisuutta: johtavuuden (perustuu kalvonläpäisevän potentiaalin ja virran arvoihin) ja todennäköisyyden olla avoimessa tilassa (määritetty kanavan ajan suhteena on avoinna virran tallennusaikaan). Muuten, useimmiten kanavan toimintaa säädellään fysiologisesti muuttamalla tätä todennäköisyyttä.
Syötä koko solun kokoonpanoon. Kanavan epiteelisolujen kerääminen. Transmembraanipotentiaali −60 mV. Pesuliuokseen ruiskutetaan 1 minuutin välein 30 sekunnin ajan amiloridia, epiteelin natriumkanavan inhibiittoria (antoaika näytetään tummilla suorakulmioilla). Muuten, herkkyys estäjille on toinen kanavan tärkeimmistä ominaisuuksista. Amiloridin lisääminen joka kerta johtaa virran pudotukseen nollaan, mikä tarkoittaa, että melkein kaikki johtavuus -60 mV:ssa tässä solussa on epiteelin natriumkanavan johtavuus . Toisin kuin aikaisemmassa tallennuksessa, nykyiset muutokset näyttävät olevan jatkuvia - tämä johtuu siitä, että useita kanavia tallennetaan samanaikaisesti (noin 2000), vastaavasti nykytasoja on noin 2000 - "kaikki auki" - "kaikki kiinni".
Tämä on tekniikka, joka on kehitetty lisäämään tuottavuutta sähköfysiologiassa, kun vaaditaan transmembraanisen konduktanssin bulkkimittauksia. Erityisesti tätä menetelmää voidaan soveltaa farmakologisessa tutkimuksessa. Jos klassisella patch-clampilla pipetti sijoitetaan kiinteään kennoon, niin tasomaisella päinvastoin solususpensio levitetään mikrosirulle, jossa on tilatut reiät, joiden halkaisija on subcellular. Kenno asettuu reikään, imeytyy siihen pumpun avulla, minkä seurauksena muodostuu gigaohmikontakti. Lisäksi tutkimus suoritetaan samalla periaatteella kuin perinteisessä patch-clampissa. [12] [13]
Tasomaisen patch-clampin tärkein etu on, että koe on paljon yksinkertaisempi, vaatii vähemmän taitoa tutkijalta ja vie vähemmän aikaa. Useita mittauksia voidaan suorittaa peräkkäin automaattisesti. Tekniikan tekijöiden mukaan tämä menetelmä helpottaa solunsisäisen sisällön perfusointia sekä tutkittujen tai testattavien farmakologisten aineiden tarkempaa annostelua. Tällä menetelmällä on suhteellisen helppoa työskennellä tavallisesti suspensiossa olevien solujen kanssa - erityisesti verisolujen kanssa.
Tasomaisella patch-clamp -menetelmällä on kuitenkin useita merkittäviä rajoituksia. Tärkeintä on, että tutkittujen solujen on oltava suspensiossa. Näin ollen ei ole mahdollista työskennellä kudosfragmenttien kanssa, on mahdotonta tutkia solujen vuorovaikutusta keskenään. Solujen mobilisoimiseksi on tarpeen käyttää proteaasientsyymejä, jotka voivat muuttaa tutkittujen ionikanavien käyttäytymistä.
Kaikki edellä oleva johtaa siihen, että tasomaista patch-clampa löytyy käyttöä lähinnä farmakologisissa seulontatutkimuksissa, joissa vaaditaan massamittauksia, mutta se ei ole niin yleistä perustieteen alalla.