Käänteisfaasikromatografia

Käänteisfaasikromatografia (RPC) on kromatografian muunnelma , jossa stationäärinen faasi on ei-polaarinen [1] . Tämä kromatografian muunnelma viittaa nestekromatografiaan (toisin kuin kaasukromatografia).

Termillä "päinvastainen vaihe" on historiallinen tausta. 1970-luvulla nestekromatografiassa käytettiin useimmissa tapauksissa kiinteää kiinteää faasia (kutsutaan myös " kolonniksi "), joka sisälsi modifioimattomia pii- tai alumiinitäyteaineita. Nykyään tämä menetelmä tunnetaan "normaalifaasikromatografiana". Normaalifaasikromatografian tapauksessa stationäärinen faasi on hydrofiilinen (sillä on korkea affiniteetti liikkuvan faasin hydrofiilisiin molekyyleihin). Siksi liikkuvan faasin hydrofiilisillä molekyyleillä on taipumus sitoutua ( adsorboitua ) pylvääseen, kun taas hydrofobiset molekyylitmolekyylit kulkevat pylvään läpi ja eluoituvat ensin. Normaalifaasikromatografiassa hydrofiiliset molekyylit voidaan eluoida kolonnista lisäämällä liikkuvan faasin liuoksen polaarisuutta.

Kiinteään emäkseen kovalenttisesti sitoutuneita alkyyliketjuja käyttävien menetelmien tulo mahdollisti sellaisen hydrofobisen stationaarifaasin luomisen, jolla on vahva affiniteetti hydrofobisia yhdisteitä kohtaan. Hydrofobisen stationaarifaasin käyttöä voidaan pitää normaalifaasikromatografian vastakohtana tai "käänteisenä" - tästä syystä termi "käänteisfaasikromatografia" [2] [3] . Käänteisfaasikromatografiassa käytetään polaarista (vesipitoista) liikkuvaa faasia. Seurauksena on, että polaarisessa liikkuvassa faasissa hydrofobiset molekyylit adsorboivat hydrofobiseen paikallaan olevaan faasiin, kun taas liikkuvassa vaiheessa hydrofiiliset molekyylit kulkevat pylvään läpi ja eluoivat ensin [2] [4] . Hydrofobiset molekyylit voidaan eluoitua pylväästä vähentämällä liikkuvan faasin napaisuutta käyttämällä orgaanisia (ei-polaarisia) liuottimia, jotka vähentävät hydrofobisia vuorovaikutuksia. Mitä enemmän hydrofobista molekyyliä on, sitä enemmän se sitoutuu paikallaan olevaan faasiin ja mitä suurempi orgaanisen liuottimen pitoisuus, jota tarvitaan kyseisen molekyylin eluutumiseen.

Monet muissa kromatografisissa menetelmissä käytetyistä matemaattisista ja kokeellisista oletuksista pätevät myös OFC:ssä (esim. "erotteluresoluutio" riippuu kolonnin pituudesta). Sitä voidaan käyttää myös monen tyyppisten molekyylien erottamiseen. Tätä menetelmää ei yleisesti käytetä proteiinien erottamiseen, koska käytetyt orgaaniset liuottimet voivat denaturoida useimmat proteiinit. Siksi tässä tapauksessa normaalifaasikromatografia on hyväksyttävämpi menetelmä.

Nykyään OFC:tä käytetään usein analyyttisiin tarkoituksiin. RPC: lle on olemassa useita erilaisia ​​paikallaan olevia vaiheita, mikä mahdollistaa enemmän joustavuutta erotusmenetelmien valinnassa.

Kiinteä (stationary) vaihe

Taulukko 1. Kääntöfaasissa HPLC: ssä käytetyt päävaiheet [5] [6] .
Nimitys Kuvaus Rakenne
C1, TMS, SAS, trimetyyli Sillä on korkea selektiivisyys polaaristen yhdisteiden ja yhdisteiden erottamisessa, jolla on suuri määrä funktionaalisia ryhmiä. Se säilyttää yhdisteet alkyyliryhmien kanssa vähiten ei-polaarisissa liuottimissa.
C2, RP-2, dimetyyli Sillä on korkeampi retentio kuin C1 ja pienempi kuin C4, C8 ja C18.
C3, propyyli Käytetään peptidien ja proteiinien hydrofobisessa vuorovaikutuskromatografiassa ( HIC ).
C4, butyyli Soveltuu HIC- ja ioniparikromatografiaan. Ei-polaarisissa liuottimissa sen retentio on pienempi kuin C8- ja C18-faasien. Tämä huokoshalkaisijaltaan 300Å materiaali on ihanteellinen suurten proteiinien ja hydrofobisten peptidien analysointiin.
C5, Pentil Huokoshalkaisijalla 300Å, sitä käytetään hydrofobisten proteiinien ja peptidien käänteiseen faasin erottamiseen. Resistentia enemmän hydrolyysille kuin C4.
C6, heksyyli Käytetään ioniparikromatografiaan. Sillä on pienempi retentio kuin C8 ja C18.
C8, MOS, RP-8, LC8, oktyyli Se on selektiivisyydessään lähellä C18:aa, mutta sen retentio on pienempi. Käytetään laajasti lääkkeiden, nukleotidien, steroidien jne. analysoinnissa. Huokoshalkaisijaltaan 300Å tämä materiaali soveltuu hyvin peptidien ja pienten hydrofiilisten proteiinien erottamiseen.
C12, dodekyyli C18:aa lyhyemmän hiiliketjun ansiosta se tarjoaa hyvän vuorovaikutuksen ja terävämmän piikkimuodon ei-polaarisille ja kohtalaisen polaarisille yhdisteille.
C18, ODS, RP-18, LC-18, oktadekyyli Klassinen käänteisfaasimateriaali, jolla on korkein retentio ei-polaarisissa liuottimissa. Toimii erinomaisesti ioniparikromatografiassa. Siinä on laajin sovellusalue (peptidien, nukleosidien, nukleotidien, steroidien, lääkkeiden, vitamiinien, rasvahappojen, torjunta -aineet jne. Erottaminen. Tätä materiaalia käytetään huokoshalkaisijalla 300å, pienten hydrofobisten peptidien erottamiseen.
C6H5 , fenyyli _ _ Sillä on ainutlaatuinen selektiivisyys ja sitä käytetään aromaattisten yhdisteiden erottamiseen. Tätä materiaalia käytetään HIC: lle, jonka huokoshalkaisija on 300å.
C6H5 ( C3H6O - linkkeri ) , fenyylieetteri _ _ Käytetään erittäin polaaristen aromaattien erottamiseen. Poikkeaa selektiivisyydeltään fenyyli- ja fenyyliheksyylifaasista.
C6H5 ( C6H12 - linkkeri ) , fenyyliheksyyli _ _ Sillä on sama selektiivisyys kuin fenyylifaasilla, mutta paljon suurempi stabiilisuus.
C6F5 , PFP _ _ Käytetään substituoitujen aromaattisten yhdisteiden analysointiin. Eroaa selektiivisyydeltään fenyyli-heksyyli-, klassisesta fenyyli- ja alkyylifaasista.
CN, CPS, PCN, syaani, syanopropyyli, nitriili Voidaan käyttää käänteisfaasi- tai normaalifaasimateriaalina. Koska tämä faasi on hieman polaarinen, sillä on erinomainen selektiivisyys polaaristen yhdisteiden erottamisessa . Lisäksi se tasapainottuu nopeasti, mikä on arvokas ominaisuus työskenneltäessä .

gradienttieluointitilassa. Käytetään erilaisten lääkkeiden analysointiin (esim. masennuslääkkeet jne.)

NH2 , APS , amino, aminopropyylisilyyli Voidaan käyttää käänteisfaasi-, normaalifaasi- ja ioninvaihtokromatografiassa (heikko anioninvaihdin). Käytetään käänteisfaasikromatografiassa hiilihydraattien erottamiseen.
OH, dioli, glyseroli Voidaan käyttää käänteisfaasi- tai normaalifaasimateriaalina. Käänteisenä faasina toimiessaan sitä käytetään peptidien ja proteiinien geelisuodatuskromatografiassa (GFC).

Mobiilivaihe

Analyyttien eluoimiseen käänteisfaasikolonnista käytetään veden tai vesipitoisten puskuriliuosten ja orgaanisten liuottimien seoksia [2] . Orgaanisten liuottimien tulee sekoittua veteen. Yleisimmät ovat asetonitriili , metanoli ja tetrahydrofuraani (THF). On myös mahdollista käyttää etanolia tai isopropanolia . Eluointi voidaan suorittaa isokraattisesti (vesi-orgaaninen liuotinseos ei muuta prosenttiosuutta koko erotusprosessin aikana) tai gradienttia käyttäen (vesi-orgaaninen liuotinsuhde muuttuu prosessin aikana, yleensä polaarisuuden vähenemisen suuntaan). Liikkuvan vaiheen pH -arvolla voi olla suuri vaikutus seoksen erottamiseen, ja se voi myös muuttaa analyysin selektiivisyyttä (analysoitujen yhdisteiden vapautumisjärjestys).

Varautuneet analyytit voidaan erottaa käänteisfaasikolonnissa ioniparien avulla (myös: ionivuorovaikutus). Tämä tekniikka tunnetaan nimellä "käänteisfaasi-ioniparikromatografia".

Muistiinpanot

  1. ↑ IUPAC Gold Book -verkkoversio: " käänteisfaasikromatografia ".
  2. ↑ 1 2 3 Akul Mehta. Käänteisfaasikromatografian periaate HPLC/UPLC (animaatiolla  ) . PharmaXChange (27. joulukuuta 2012). Haettu 10. tammikuuta 2013. Arkistoitu alkuperäisestä 15. huhtikuuta 2013.
  3. ↑ I Molnár ja C Horvath. Polaaristen biologisten aineiden käänteisfaasikromatografia: katekoliyhdisteiden erottaminen korkean suorituskyvyn nestekromatografialla  (englanniksi)  // Clinical Chemistry : Journal. - 1976. - syyskuu ( osa 22 , nro 9 ) . - P. 1497-1502 . — PMID 8221 .
  4. ↑ (Clinical Biochemistry, TWHrubey, 54)
  5. ↑ Phenomenex. HPLC-sidotut faasit . http://www.phenomenex.com . Haettu 3. syyskuuta 2017. Arkistoitu alkuperäisestä 3. syyskuuta 2017.
  6. ↑ Aquilon. Lyhyt opas HPLC:hen . www.akvilon.su _

Linkit

  Siirry Wikidata-kohteeseen  Sanakirjat ja tietosanakirjat