Kromatiinivuorovaikutusanalyysi paripään tunnistesekvensoinnilla (ChIA-PET) on molekyylibiologinen menetelmä, jonka avulla voit määrittää genomissa huomattavan etäisyyden päässä toisistaan olevien kromatiinialueiden vuorovaikutukset (tilallinen läheisyys) . [1] Tällaiset vuorovaikutukset ovat kiinnostavia sääntelyelementtien määrittämisen kannalta . Solujen säätelyelementit voivat sijaita huomattavan kaukana säädellyn geenin promoottorista (esimerkiksi cis-säätelyelementit , transsäätelyelementit , eristimet , tehostajat ). Tällaisten vuorovaikutusten mekanismien ymmärtämiseksi on tarpeen tuntea kromatiinialueiden spatiaalinen järjestely suhteessa toisiinsa, mikä tällä menetelmällä mahdollistaa de novo määrittämisen . Saadut tiedot ovat puolestaan tärkeitä geeniekspression säätelymekanismien ymmärtämiselle . [2]
ChIA-PET perustuu ChIP :n , 3C:n ( Chromosome Conformation Determination ) ja Paired -end tag -sekvensoinnin käyttöön, joissa käytetään korkean suorituskyvyn sekvensointia ja tulosten jatkokäsittelyä tietokoneella. [3]
Menetelmää käytettiin ensimmäisen kerran vuonna 2009 [1] ihmisen rintasyövän etäisten ER-alfan sitoutumiskohtien määrittämiseen. Myöhemmin sitä käytettiin esimerkiksi CTCF :n välittämän interaktomin (mahdollisten vuorovaikutusten kartta) rakentamiseen hiiren alkion kantasoluissa [4] .
ChIA-PET yhdistää sekä ChIP- että 3C [5] -pohjaisten menetelmien ominaisuudet, mikä parantaa kummankin ominaisuuksia. Perinteisellä ChIP-menetelmällä voit määrittää tietyn proteiinin vuorovaikutuksen DNA :n kanssa ja sitä voidaan käyttää transkriptiotekijän sitoutumiskohtien etsimiseen . Käyttämällä ChIP-seq :a, mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin de novo -sitoutumiskohdat voidaan määrittää koko genomissa. Jos proteiini sitoo kromatiinin alueita, jotka ovat kaukana toisistaan kromosomissa , mutta lähellä avaruutta, ChIP-seq voi tunnistaa niistä jokaisen, mutta ei osoita niiden vuorovaikutusta. Kaikki ChIP-seq-menetelmällä määritetyt sekvenssit eivät kuitenkaan ole yksilöllisesti kartoitettu genomissa, eivätkä kaikki ole toiminnallisia sitoutumiskohtia [6] .
3C- ja ChIA-PET-menetelmät perustuvat proksimaalisen ligaation ( proximity ligaation ) teoriaan, jonka mukaan proteiinikompleksiin liittyvien kromatiinialueiden lähellä olevat päät ligoidaan toisiinsa suuremmalla todennäköisyydellä kuin alueiden päät liuoksessa tai liittyvät toiseen proteiinikompleksiin.
3C-menetelmällä voidaan määrittää kromatiinin spatiaalinen rakenne, mutta se ei salli vuorovaikutuksessa olevan proteiinin määrittämistä [5] . Merkittävä ongelma on tarve saada tarkkaa tietoa vuorovaikutuksessa olevien lokusten järjestyksestä . Tämä on tarpeen alukkeiden valitsemiseksi kvantitatiiviseen tai puolikvantitatiiviseen PCR-analyysiin , jota käytetään niiden määrittämiseen. (Tulee huomata, että 3C-menetelmällä määritettyjä lokuksia - ehdokkaita vuorovaikutuksille - voi olla useita). ChIA-PET-menetelmä mahdollistaa tiettyyn proteiiniin liittyvän kromatiinin spatiaalisen rakenteen de novo -määrityksen. Eli toisaalta se ei vaadi tietoa DNA-sekvenssistä vuorovaikutuksen alueella, ja toisaalta se riippuu täysin käytettyjen vasta -aineiden spesifisyydestä .
| Siru | ChIP sek | ChIA-PET | 3C | |
|---|---|---|---|---|
| Tarvitaan erityisiä vasta-aineita | + | + | + | - |
| On välttämätöntä tietää tutkitun lokuksen DNA-sekvenssi | + | - | - | + |
| Referenssigenomi vaaditaan | - | + | + | - |
| Menetelmä tarjoaa tietoa | Sitovat sivustot | Tietoja de novo -sidospaikoista |
Tietoja de novo -sitoutumiskohdista + kromatiinin konformaatiosta |
Kromatiinin konformaatiot |
DNA-proteiinikompleksit silloitetaan epäspesifisesti formaldehydin kanssa. Näyte altistetaan ultraäänelle , kun taas DNA-molekyylit murskataan fragmenteiksi ja löyhästi sitoutuneet epäspesifiset kompleksit tuhoutuvat. Tämän seurauksena DNA-fragmentteja saadaan vahvoina komplekseina proteiinien kanssa. Lisäksi magneettihelmiin kiinnitettyjen spesifisten vasta-aineiden avulla kiinnostavaan proteiiniin liittyvät kromatiinifragmentit saostetaan. Usein tutkimuksen kohteina ovat tunnetut transkriptiotekijät [1] . Saostuneet kompleksit poistetaan liuoksesta magneettihelmillä käyttämällä magneettia. Eristetyt kompleksit jaetaan kahteen osaan ja DNA-molekyylien päihin "ommellaan" oligonukleotidipuolilinkkerit , joilla on tunnettu sekvenssi . Puolilinkkeri A on toisessa alikvootissa ja puolilinkkeri B on toisessa. Molemmat puolilinkkerit sisältävät MmeI-restriktioentsyymin tunnistaman kohdan ja eroavat toisistaan kahden nukleotidin "viivakoodilla" : CG puoli- linkkeri A ja AT puolilinkkerille B. Tämän seurauksena linkkerit voidaan myöhemmin, sekvensoinnin aikana erottaa toisistaan "viivakoodilla". Seuraavassa vaiheessa yhdistetään kaksi alikvoottia ja tapahtuu proksimaalinen ligaatio, jolloin puolilinkkerit ligoidaan toistensa päälle täyspitkien linkkereiden muodostamiseksi. Linkkerejä, joissa on AA (CG/CG) tai BB (AT/AT) "viivakoodit", pidetään todennäköisinä ligaatiotuotteina samassa kompleksissa, kun taas linkkerejä, joissa on AB (CG/AT) "viivakoodeja" pidetään kimeerisinä ligaatiotuotteina DNA : sta, joka liittyy erilaisiin proteiinikompleksit Sekvensoinnin valmisteluun kuuluu kompleksien prosessointi MmeI-restriktioentsyymillä [8] , joka pilkkoo DNA:n tietyn etäisyyden päässä tunnistuskohdasta puolilinkkerissä. Tämän seurauksena tämän vaiheen lopussa saadaan konstrukteja, jotka sisältävät parin "tunnisteita" ( eng. tag ) (kukin 20 bp) täyden linkkerin (38 bp) molemmilla puolilla. Tuloksena saadut fragmentit sekvensoidaan molemmista päistä ( PET ) . Tunnisteet kartoitetaan sitten genomiin. [7] [9]
Sekvensointitulosten tietokonekäsittely sisältää 6 moduulia [7] [10]
Kaikki lukusekvenssit on jaettu sekvensseihin, joissa on luettavat "viivakoodit" ja ei-luettavat "viivakoodit". Jos "viivakoodia" ei voida lukea, sekvenssi "hylätään" käsittelystä. Jos "viivakoodi" voidaan lukea, sekvenssit kohdistetaan linkkereihin. Kaikki saadut sekvenssit on jaettu kimeerisiin (muodostettu ligaatiolla DNA:sta eri komplekseista ja jotka sisältävät A/B-linkkerin) ja ei-kimeerisiin (sisältävät A/A- tai B/B-linkkerin). On huomattava, että A/A:n tai B/B:n sisältävien sekvenssien joukossa voi esiintyä myös kimeerisiä. Lisäksi itse linkkereiden sekvenssit "hylätään" ja "merkkien" (PET) sekvenssit analysoidaan. [7] [10]
PET:ien kartoitusEdellisessä vaiheessa saadut sekvenssit kartoitetaan referenssigenomiin. Ensimmäisessä vaiheessa eristetään 100-prosenttisesti kohdistettuja sekvenssejä , jotka voidaan kartoittaa yhteen lokukseen (ainutlaatuinen) tai useisiin lokuksiin. Jäljelle jäävistä sekvensseistä eristetään ne, jotka sisältävät 1 substituution sekvenssissä ( englanniksi missmatch ) referenssigenomin kanssa, ne jaetaan myös uniikkeihin ja sekvensseihin, joissa on useita kartoituksia. Kaikki muut sekvenssit ovat kartoittamattomia. Kaikki sekvenssit paitsi yksilöllisesti kartoitetut sekvenssit "hylätään" käsittelystä. [7] [10]
PET:ien luokitusPET:itä on kaksi ryhmää: "self-ligated" ( englanninkieliset self- ligation PETs) ja "interligated" ( englanniksi inter- ligation PETs ). "Self-ligated" ( englanniksi self-ligation PETs ) vastaavat yhden ChIP-DNA-fragmentin päitä, niiden tulisi sijaita samassa kromosomissa lyhyen matkan päässä toisistaan, "head to tail" -suunnassa. "Interligoidut" ( eng. inter- ligation PETs) jaetaan intrakromosomaalisiin (kartoitettu samaan kromosomiin suurelta etäisyydeltä), kromosomaalisiin (kartoitettu eri kromosomeihin) ja ligatoituihin eri orientaatioihin ( eng. different orientation ligaation PETs ) (kartoitettu) samassa kromosomissa lyhyen matkan päässä, mutta väärässä suunnassa tai eri DNA-säikeissä). Raja, joka erottaa "itseligoidut" PET:t "interligoiduista" PET:istä, määräytyy luonnollisesti tietyllä "ääni"-intensiteetillä saatujen DNA-fragmenttien pituuden perusteella. Eri kokeissa se oli 3-4,6 Kb. [7] [10]
Proteiinia sitovien kohtien määritysItseligaatiotunnisteita ( itseligaatio-PET:itä ) käytetään proteiinien sitoutumiskohtien määrittämiseen . Menettely on samanlainen kuin ChIP-seq :ssä .
Kromatiinivuorovaikutusten määritelmäTämän tyyppisen vuorovaikutuksen ennustamisessa käytetään "interligation" PET:itä .
Tulosten visualisointi ja organisointiAiempien vaiheiden tiedot syötetään tietokantoihin tallennusta, käsittelyä ja mahdollista visualisointia varten.
ChIA-PET-kokeissa käytetään seuraavia tietokoneohjelmia