Ligaatiovapaa kloonaus ( LIC , Ligation Independent Cloning ) geenitekniikassa on menetelmä plasmidien saamiseksi, joka ei käytä restriktio- ja ligaatioreaktioita.
Ligaasivapaan kloonauksen tekniikka vähentää aikaa uusien geneettisten konstruktien luomiseen, esimerkiksi rekombinanttiproteiinin ilmentämiseen , ja soveltuu parhaiten korkean suorituskyvyn proteiinien tuotantolinjaan. Ligaatiovapaata kloonausta varten on tarpeen valmistaa LIC-vektori - linearisoitu DNA-sekvenssi , jossa on spesifiset tahmeat päät , joiden pituus on 11-14 nukleotidia . Tätä varten vektorimolekyyli hydrolysoidaan restriktioentsyymillä yhdessä paikassa ja käsitellään sitten T4-faagi-DNA-polymeraasilla yhden nukleotidin läsnä ollessa. Tämän entsyymin 3'-eksonukleaasiaktiivisuus johtaa nukleotidien poistamiseen 3'-päästä, kunnes reaktioseoksessa oleva nukleotidi löytyy sekvenssistä (katso kuva). Vektorimolekyyli on erityisesti valmistettu siten, että tämä nukleotidi ei esiinny restriktiokohdan molemmilla puolilla 11-14 yksikön ajan. Kun LIC-vektori on eristetty, se voidaan varastoida ja käyttää uudelleen kohdeproteiinigeenien kloonaamiseen siihen. Näiden geenien PCR - alukkeet valitaan siten, että ne ovat toisaalta komplementaarisia kohdegeenin alkuun tai loppuun nähden ja toisaalta LIC-vektorin tahmeiden alueiden kanssa. Sitten PCR:n jälkeen saadaan proteiinigeeni, jossa molemmilla puolilla on 11-14 nukleotidin pituisia yksijuosteisia vektorille komplementaarisia sekvenssejä . Riittää, kun sekoitetaan tällainen tuote vektorin kanssa ja transformoidaan kompetentit bakteerisolut seoksella plasmidien saamiseksi proteiinigeenin kanssa. Siten ligaatiovapaalla kloonauksella vältetään useita restriktio-, geeliytymis- ja ligaatiovaiheita, jotka kaikki voivat aiheuttaa kloonausvirheitä.
1. De Jong, R. Enzyme Free Cloning for high performance geenikloonausta ja -ilmentymistä / R. de Jong, M. Daniels, R. Kaptein ja G. Folkers // J. Struct. Toiminto. Genomiikka. - 2006. - V. 7. - P. 109–118.
2. Lee, J. High-throughput T7 LIC-vektori C-terminaalisten polyhistidiinimerkkien lisäämiseen vaihtelevilla pituuksilla ilman ylimääräisiä sekvenssejä / J. Lee ja S. Kim // Prot. Expr. Purif. - 2009. - V. 63. - P. 58–61.
3. Novy, R. Ligation Independent Cloning: Efficient Directional Cloning of PCR Products / R. Novy, K. Yaeger ja K. Kolb // Innovations. - 1997. - V. 5. - P. 1-3.
4. Bardóczy, V. Sarja ligaatiosta riippumattomia in vitro -translaatiovektoreita eukaryoottisten proteiinien tuotantoon / V. Bardóczy, V. Géczi, T. Sawasaki, Y. Endo ja T. Mészáros // BMC Biotechnology. - 2008. - V. 8. - Nro 32. - P. 1-7.