Bisulfiittisekvensointi on yleinen nimi menetelmäryhmälle, jonka tarkoituksena on tutkia DNA:n metylaatiomallia käsittelemällä sitä bisulfiitilla .
Metylaatio on ensimmäinen löydetty epigeneettinen leimaus. Se vaikuttaa geeniekspression tasoon estämällä transkription aktiivisuutta. Lisäksi monissa tapauksissa metylaatio on periytyvää [1] [2] , mikä lisää sen tutkimukseen mielenkiintoa.
Bisulfiitti vaikuttaa yksijuosteiseen DNA : han ja muuttaa sytosiinin urasiiliksi [3] . Jos tämä sytosiini on metyloitu, eli metyyliryhmä on kiinnittynyt sen viidenteen hiiliatomiin , tällainen sytosiini ei muutu. Siten bisulfiitti muuttaa DNA-sekvenssiä metylaatiomallistaan riippuen, ja sille altistumisen jälkeen on mahdollista määrittää, mitkä CpG-dinukleotidit metyloituivat vertaamalla muutettua sekvenssiä alkuperäiseen.
Alla kuvatuissa menetelmissä käytetään bisulfiitilla käsiteltyjen DNA-alueiden sekvensointia metylaatiomallin määrittämiseen. On myös menetelmiä, jotka eivät perustu sekvensointiin, kuten yhdistetty bisulfiittirestriktioanalyysi ( COBRA ) ja metyloidun DNA:n immunosaostus ( MeDIP ). Metylaatiomallien tutkimisen tehtävät voivat koostua sekä tietyn sytosiinin metylaation tutkimisesta että metyloituneiden sytosiinien osuuden määrittämisestä tietyllä DNA-alueella tai jopa koko genomissa . Seuraavista menetelmistä jotkut sopivat paremmin tiettyjen metylaatiokohtien tutkimiseen, kun taas toiset sopivat paremmin metylaation tutkimiseen korkeammilla tasoilla. Ihannetapauksessa kunkin alleelin metylaatio tulisi määrittää . Useita katsauksia [4] [5] [6] [7] [8] on omistettu bisulfiittisekvensointimenetelmien kuvaukselle .
Ensimmäinen bisulfiittisekvensointimenetelmä kuvattiin vuonna 1992 [9] . Metylaatiomallin määrittämiseen käytettiin PCR:ää, jonka alukkeet olivat spesifisiä sekä bisulfiitin muuttuneelle että muuttumattomalle DNA:lle, eli ne eivät sisältäneet CpG-dinukleotideihin sisältyviä sytosiineja . Alukkeille käytettiin alueita, jotka olivat lähellä kiinnostavaa metylaatiokohtaa, mutta jotka eivät sisältäneet sitä. Siinä tapauksessa, että sytosiini ei ollut metyloitunut, tymiiniä ( urasiili ) löydettiin monistetusta sekvenssistä ja adeniinia löydettiin syntetisoidusta komplementaarisesta sekvenssistä . Jos sytosiini metyloitiin, se pysyi monistetussa sekvenssissä ja guaniini syntetisoitiin komplementaarisessa sekvenssissä . Tämä menetelmä on erittäin työvoimavaltainen, koska se vaatii PCR-tuotteiden kloonauksen vaaditun herkkyyden saavuttamiseksi. Sama ongelma voidaan ratkaista käyttämällä sisäkkäistä PCR :ää .
Pyrosekvensoinnissa PCR:ää käytetään alukkeiden kanssa, jotka monistavat sekä muunnettua että muuntamatonta DNA:ta bisulfiitilla. Metyloituneiden ja metyloitumattomien sytosiinien lukumäärän suhde monistettavassa sekvenssissä määräytyy syntetisoidun komplementaarisen sekvenssin A- ja G - nukleotidien lukumäärän suhteena [10] [11] .
Tämän menetelmän lisäparannus on alleelispesifisten alukkeiden käyttö yhden nukleotidin polymorfismeilla , mikä mahdollistaa metylaatiomallien tutkimisen erikseen isän ja äidin alleeleissa, mikä on erityisen hyödyllistä genomisen painamisen tutkimuksessa [12] .
Tämä menetelmä perustuu yksijuosteiseen konformaatiopolymorfismianalyysiin ( SSCA ) . SSCA kehitettiin havaitsemaan yhden nukleotidin polymorfismia (SNP) [13] . Samanpituiset, mutta eri nukleotidisekvenssin omaavat DNA-fragmentit liikkuvat eri nopeuksilla elektroforeesissa . Yleisesti ottaen SSCA ei ole tarpeeksi herkkä havaitsemaan yksittäistä substituutiota, mutta riittävä määrä metyloitumattomien CpG-dinukleotidien polymorfismeja bisulfiittikäsitellyssä ja käsittelemättömässä DNA:ssa riittää, että menetelmän herkkyys on riittävä määrittämään metyloidut sytosiinit tarkasteltavalla alueella. Tällä menetelmällä ei voida tutkia metylaatiota tietyssä paikassa, mutta se antaa käsityksen metylaatiosta tietyn alueen tai jopa koko genomin tasolla.
High Sensitivity Melting Method ( HRM) perustuu reaaliaikaiseen PCR :ään [14] . Lämpötila nostetaan 55 °C:sta 95 °C:seen, minkä seurauksena ketjujen väliset komplementaariset sidokset tuhoutuvat. Sulamisnopeus mitataan erityisillä fluoresoivilla väreillä, ja kun tiedetään fluoresenssin riippuvuus ketjujen nukleotidisekvenssistä, voidaan erottaa yksittäisen nukleotidin polymorfismit. Menetelmä ei anna tarkalleen tietoa siitä, mitkä CpG-dinukleotidit metyloituivat, eikä siksi muuttuneet bisulfiittikäsittelyn aikana, mutta se antaa melko tarkkaa tietoa niiden määrästä kiinnostavalla alueella.
Yhden nukleotidin alukkeen pidennysmenetelmä kehitettiin alun perin yhden nukleotidin polymorfismien analysointiin [15] . Metylaation analyysin yhteydessä sitä käytetään seuraavasti. Bisulfiitilla käsitellyssä yksijuosteisessa DNA:ssa alukkeet liitetään emäspariin, joka on välittömästi ennen kiinnostuksen kohteena olevaa metylaatiokohtaa. Aluketta jatketaan sitten DNA-polymeraasilla käyttämällä dideoksinukleotideja , jotka päättävät sen . Metyloituneiden ja metyloitumattomien sytosiinien lukumäärän suhde alkusekvenssissä määräytyy G- ja A- nukleotidin sisältävien alukepidennysten lukumäärän suhteella . Metyloituneiden ja metyloitumattomien sytosiinien lukumäärän suhde alkusekvenssissä voidaan määrittää eri tavoin. Käytetään radioaktiivisia tai fluoresoivia leimoja , samoin kuin pyrosekvensointia [16] .
Lisäksi tämä voidaan tehdä käyttämällä matriisiavusteista laserdesorptiota/ionisaatiota , jonka jälkeen käytetään lentoaikamassaanalysaattoria (MALDI-TOF) tai ioniparin käänteisfaasia korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (IP-RP- HPLC) [17] .
Menetelmä perustuu spesifisen RNA -katkaisun käyttöön [18] . Kun PCR:ssä alukkeeseen lisätään in vitro RNA-polymeraasipromoottori , syntetisoidaan kiinnostavan alueen RNA-transkripti , jonka jälkeen ribonukleaasi A pilkkoo sen . Ribonukleaasi A pilkkoo yksijuosteisen RNA:n C- ja U -nukleotidien kohdista . Käyttämällä katkaisuresistenttejä nukleosiditrifosfaatteja dUTP ja dCTP voidaan saavuttaa spesifinen katkaisu C- tai Y-kohdissa. Sitten RNA-fragmentit analysoidaan MALDI - TOF :lla . Tämä menetelmä tarjoaa tietoa kunkin saatavilla olevan CpG-dinukleotidin metylaatiosta, ei vain metyloituneiden nukleotidien osuudesta.
Tämä menetelmä käyttää alukkeita, jotka ovat spesifisiä joko vain bisulfiittitransformoidulle DNA:lle tai vain transformoimattomalle DNA:lle [19] . Näin ollen vain ne alueet, jotka metyloituivat, on kiinnittynyt ensimmäisiin alukkeisiin, ja ne, jotka eivät olleet metyloituneita, kiinnitetään toisiin alukkeisiin, mikä eliminoi tarpeen sekvensoida alueita monistamisen jälkeen.
MSP:ssä monistettua DNA:ta voidaan analysoida edelleen useilla muilla menetelmillä. MethyLight-menetelmä käyttää fluoresenssiin perustuvaa reaaliaikaista MSP:tä [20] . Mc-MSP käyttää sulamiskäyräanalyysiä [21] . Erittäin herkkä sulatusmenetelmä käyttää molempia ja on siksi riittävän herkkä havaitsemaan alhainen metylaatio [22] .
DNA-mikrosirujen käyttö mahdollistaa edellä kuvattujen metylaation analysointimenetelmien laajentamisen koko genomin tasolla [23] . DNA-mikroarray- oligonukleotidit on tehty metylaatiospesifisiksi ja ne vastaavat kiinnostavia CpG-kohtia. Jotkut ovat komplementaarisia bisulfiitilla muunnetulle sekvenssille (eli sille, jossa CpG-kohtaa ei ole metyloitu), kun taas toiset eivät ole. Esimerkki tällaisesta menetelmästä on Illumina metylaatiomääritys .
Bisulfiittisekvensointimenetelmillä on useita rajoituksia. Nisäkkäillä DNA -modifikaatio 5-hydroksimetyylisytosiini on laajalle levinnyt. Bisulfiitilla käsiteltynä 5-hydroksimetyylisytosiini muuttuu sytosiini-5-metyylisulfonaatiksi, joka tunnistetaan sekvensoinnilla C:ksi. Näin ollen bisulfiittisekvensointi ei voi erottaa 5 - hydroksimetyylisytosiinia metyylisytosiinista , eikä sitä siksi voida pitää menetelmänä herkkänä. vain metylaatio-DNA:lle. Vuonna 2012 kehitettiin bisulfiittisekvensointimenetelmä erottamaan nämä kaksi modifikaatiota [24] .
Koska typpipitoisten emästen epätäydellinen konversio DNA:ssa bisulfiitilla, mikä on mahdollista vain yksijuosteisessa DNA:ssa, antaa vääriä tuloksia, koeolosuhteiden ( lämpötila , suolapitoisuus) tarkka valinta on välttämätöntä DNA:n pitämiseksi denaturoituneessa tilassa [4] . DNA:n yksijuosteisen konformaation ylläpitämistä voidaan helpottaa kiinnittämällä se agaroosigeeliin [25] .
Toinen ongelma on DNA:n hajoaminen, kun sitä käsitellään bisulfiitilla. Koska bisulfiitti vaikuttaa vain yksijuosteiseen DNA:han, on välttämätöntä suorittaa reaktio olosuhteissa, joissa DNA pysyisi yksijuosteisena, ja suorittaa se riittävän pitkään onnistuneeseen konversioon. Tällaiset olosuhteet, nimittäin korkea lämpötila ja pitkä inkubaatioaika, voivat kuitenkin johtaa jopa 90 %:n koko DNA:n hajoamiseen [26] .