Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC, englantilainen HPLC , korkean suorituskyvyn nestekromatografia ) on yksi tehokkaista menetelmistä aineiden monimutkaisten seosten erottamiseksi , jota käytetään laajasti sekä analyyttisessä kemiassa että kemiallisessa tekniikassa . Kromatografisen erottelun perusta on seoksen komponenttien osallistuminen, joka on erotettu van der Waals -vuorovaikutusten kompleksisessa järjestelmässä (pääasiassa molekyylienväliset) käyttöliittymässä. Analyysimenetelmänä HPLC on osa menetelmäryhmää, joka sisältää tutkittavien kohteiden monimutkaisuuden vuoksi alustavan kompleksisen seoksen erottamisen suhteellisen yksinkertaisiksi. Saadut yksinkertaiset seokset analysoidaan sitten tavanomaisilla fysikaalis - kemiallisilla menetelmillä tai erityisillä kromatografiaa varten kehitetyillä menetelmillä .
Nestemäisen kromatografian periaatteena on erottaa seoksen komponentit, jotka perustuvat niiden tasapainojakauman eroon kahden sekoittumattoman vaiheen välillä, joista toinen on paikallaan ja toinen on liikkuva ( eluentti ).
HPLC: n erottuva piirre on korkean paineen (jopa 400 bar ) ja hienorakeisten sorbenttien (yleensä 3–5 um , nyt jopa 1,8 um) käyttö. Tämä mahdollistaa monimutkaisten aineseosten erottamisen nopeasti ja täydellisesti (keskimääräinen analyysiaika on 3-30 min ).
HPLC -menetelmää käytetään laajasti aloilla, kuten kemia , petrokemia , biologia , bioteknologia , lääketiede , elintarvikkeiden jalostus , ympäristönsuojelu , lääkkeiden tuotanto ja monet muut.
Analysoitujen tai erotettujen aineiden erotusmekanismin mukaan HPLC jaetaan adsorptioon , jakautumiseen , ioninvaihtoon , poissulkemiseen , ligandinvaihtoon ja muihin.
On pidettävä mielessä, että käytännön työssä erottaminen ei usein etene yhdellä, vaan useilla mekanismeilla samanaikaisesti. Siten syrjäytymisen erottaminen voi olla monimutkaista adsorptiovaikutuksilla, adsorptio -jakaumalla ja päinvastoin. Lisäksi, mitä suurempi näytteen aineiden ero on ionisaation , emäksisyyden tai happamuuden asteen , molekyylipainon , polarisoituvuuden ja muiden parametrien suhteen, sitä todennäköisemmin on, että tällaisille aineille ilmenee erilainen erotusmekanismi.
Kiinteä faasi on polaarisempi kuin liikkuva faasi, joten ei-polaarinen liuotin vallitsee eluentin koostumuksessa:
Katso myös käänteinen faasikromatografia
Käänteisfaasi- HPLC ( RP-HPLC käänteisfaasista - käänteisfaasi ) suoritetaan käyttämällä ei-polaarista stationaarifaasia ja polaarisia (vesipitoisia) liuottimia . Stationaarifaasi on tavanomainen silikageeli, jonka pinta on modifioitu RMe2SiCl: lla , jossa R on suoraketjuinen alkyyliryhmä , kuten C18H37 tai C8H17 . Tämän mukaisesti erotetaan kolonnit, joissa on RP-18- ja/tai RP-8-materiaalia. Samanlaisilla stationaarisilla faaseilla retentioajat ovat pidemmät vähemmän polaarisille molekyyleille , kun taas polaariset molekyylit eluoituvat nopeammin (aiemmin analyyttisessä HPLC:ssä). On mahdollista pidentää retentioaikaa lisäämällä enemmän vettä liikkuvaan faasiin, jolloin hydrofobisen analyytin affiniteetti hydrofobiseen stationaarifaasiin on vahvempi verrattuna nyt hydrofiilisempään liikkuvaan faasiin. Samoin on mahdollista vähentää retentioaikaa lisäämällä orgaanista liuotinta eluenteihin (mobiili vaihe). Käänteinen vaihe HPLC: tä käytetään niin usein, että sitä kuvataan usein väärin yksinkertaisesti HPLC: ksi ilman ylimääräistä merkintää. Apteekissa käänteistä faasi -HPLC: tä käytetään pakollisena menetelmänä lääkkeiden analysoimiseksi ennen niiden vapautumista.
RP-HPLC toimii hydrofobisten vuorovaikutusten periaatteessa, joka johtuu vesimolekyylin dipolirakenteen korkeasta symmetriasta ja jolla on tärkein rooli kaikissa elämäntieteiden prosesseissa. RP-HPLC mittaa näitä vuorovaikutusvoimia. Analyytin sitoutuminen paikallaan olevaan (paikallaan olevaan) vaiheeseen on verrannollinen kontaktin pinta-alaan analyyttimolekyylin ei-polaarisen segmentin ympärillä paikallaan olevan faasiligandin kanssa. Tätä solvofobista vaikutusta hallitsee veden voima "vähentää onteloita" analyytin ja C18-ketjun ympärillä verrattuna molempien kompleksiin. Tällä tavalla vapautuva energia on verrannollinen eluentin pintajännitykseen (vesi: 7,3 × 10–6 J/cm², metanoli: 2,2 × 10–6 J/cm²) ja vastaavasti analyytin ja ligandin hydrofobiseen pintaan. Aineen pidättymistä kolonnissa voidaan vähentää lisäämällä liikkuvaan faasiin vähemmän polaarista liuotinta (metanoli, asetonitriili) veden pintajännityksen alentamiseksi. Liuotingradientti hyödyntää tätä vaikutusta vähentämällä automaattisesti vesipitoisen liikkuvan faasin napaisuutta ja pintajännitystä analyysin aikana.
Analyyttimolekyylin rakenteellisilla ominaisuuksilla on tärkeä rooli sen retention ominaisuuksissa stationaarifaasissa. Yleensä analyytti, jossa on suuri hydrofobinen osuus (C-H, C-C ja yleensä ei-polaariset atomisidokset, kuten SS ja muut), säilyy pidempään, koska se ei ole vuorovaikutuksessa veden pinnan kanssa. Toisaalta analyytit, joiden rakenteessa on suuria polaarisia osia (joiden rakenteessa on polaarisia ryhmiä, kuten -OH, -NH2 , COO- tai -NH3 + ) , säilyvät vähemmän, koska ne sitoutuvat paremmin veteen. Tällaiset vuorovaikutukset voivat altistua steerisille vaikutuksille: erittäin suurilla molekyyleillä voi olla vain rajoitettu pääsy stationaarifaasin huokosiin, joissa tapahtuu vuorovaikutuksia pintaligandien (alkyyliketjujen) kanssa. Tällainen pinnan tukkeutuminen johtaa yleensä vähentyneeseen retentioon.
Retentioaika kasvaa kasvavan hydrofobisen (ei-polaarisen) pinta-alan myötä. Haarautuneet ketjuyhdisteet pestään paljon nopeammin kuin vastaavat lineaariset isomeerit, koska kokonaispinta -ala on vähentynyt. Samanlaiset orgaaniset yhdisteet, joissa on yksittäiset C-C-sidokset, pestään myöhemmin kuin vastaavat yhdisteet, joissa on C = C-sidoksia tai kolminkertaisia C-C-sidoksia, koska kaksois- tai kolminkertaiset sidokset ovat lyhyempiä kuin yksi C-C-sidos.
Riippumatta liikkuvan faasin pintajännityksestä (organisaatiolujuus eluentin rakenteessa), muut liikkuvan faasin ominaisuudet voivat vaikuttaa analyytin retentioaikaan. Esimerkiksi epäorgaanisten suolojen lisääminen aiheuttaa vesiliuosten pintajännityksen kohtalaisen lineaarisen nousun (n. 1,5⋅10 -7 J/cm² per mooli NaCl:lle, 2,5⋅10 -7 J/cm² per mooli (NH 4 ) ) 2 SO 4 ) ja siksi Koska analyyttiliuoksen entropiaa säätelee pintajännitys, suolojen lisääminen johtaa retentioajan pidentymiseen. Samanlaista tekniikkaa käytetään proteiinien sujuvaan erottamiseen ja talteenottoon ja niiden biologisen aktiivisuuden suojaamiseen proteiinianalyysissä (tekniikkaa kutsutaan hydrofobiseksi vuorovaikutukseksi kromatografiaksi, HIC).
Toinen tärkeä tekijä on liikkuvan faasin pH , koska se voi muuttaa analyytin hydrofobista luonnetta. Tätä varten monet menetelmät käyttävät puskurointiainetta, kuten natriumfosfaattia , pH:n säätelyyn. Puskuriliuokset palvelevat useita tarkoituksia: säätelevät pH:ta, neutraloivat paikallaan olevan faasin varausta silikageelin pinnalla ja toimivat ionipareja muodostavina aineina analyytin varauksen neutraloimiseksi. Ammoniumformiaattia käytetään usein massaspektrometriassa parantamaan tiettyjen analyyttien havaitsemista muodostamalla analyytti- ammoniumaddukteja . Haihtuvia orgaanisia happoja, kuten etikkahappoa , tai yleisemmin muurahaishappoa , lisätään usein liikkuvaan faasiin, jos massaspektrometriaa käytetään kolonnin eluointikomponentin analysointiin. Trifluorietikkahappoa ei käytetä usein massaspektrometriassa, koska se jää ilmaisimeen ja liuottimen syöttöjärjestelmään. Se voi kuitenkin olla tehokas parantamaan analyyttien, kuten karboksyylihappojen, retentiota . Happojen ja puskuriliuosten vaikutukset vaihtelevat käyttötyypistä riippuen, mutta yleensä ne parantavat kromatografian tuloksia.
RP-HPLC-kolonnit ovat suhteellisen vaikeita vaurioitua verrattuna normaaleihin piidioksidikolonniin. Monet RP-kolonnit koostuvat kuitenkin silikageelin alkyylijohdannaisista, ja niiden käyttö vesipitoisten emästen kanssa on ehdottomasti kielletty, koska ne tuhoavat silikageelin päähiukkaset. Niitä voidaan käyttää happojen vesiliuosten kanssa, mutta kolonnia ei saa altistaa hapoille pitkään, koska tämä voi syövyttää HPLC-laitteen metalliosia. RP-HPLC-kolonnit tulee huuhdella puhtaalla liuottimella käytön jälkeen happojen ja puskureiden poistamiseksi ja varastoida "sopivassa liuottimessa" (esim. huuhtele metanolilla ja jätä pumpun letkut alkoholiin, jotta ilmaa ei pääse kolonniin). HPLC-kolonnien metallipitoisuus on pidettävä alhaisena, jos halutaan säilyttää kyky erottaa aineita parhaalla tavalla. Hyvä testi kolonnin metallipitoisuudelle on 2,2'- ja 4,4'-bipyridiinin ( bipyridiinin ) seoksen sisältävän näytteen injektointi . Koska 2,2'-bipyridiini voi kelatoitua metallien kanssa, 2,2'-bipyridiinin piikin muoto vääristyy ("hännällä"), jos metalli-ioneja on läsnä silikageelin pinnalla.
HPLC:ssä käytetyt matriisit ovat epäorgaanisia yhdisteitä, kuten piidioksidia ( silikageeli ) tai alumiinioksidia , tai orgaanisia polymeerejä, kuten polystyreeniä (silloitettu divinyylibentseenillä) tai polymetakrylaattia. Silikageeli on tietysti nykyään yleisesti hyväksytty.
Matriisin tärkeimmät ominaisuudet:
Silikageelin saaminen HPLC:tä varten:
Sorbenttihiukkaset:
Huokoskoko HPLC:ssä on yksi tärkeimmistä parametreista. Mitä pienempi huokoskoko on, sitä huonompi niiden läpäisevyys eluoituneiden aineiden molekyyleille. Ja näin ollen, mitä huonompi on sorbenttien sorptiokyky. Mitä suuremmat huokoset ovat, sitä pienempi on ensinnäkin sorbenttihiukkasten mekaaninen stabiilisuus, ja toiseksi, mitä pienempi on sorptiopinta, joten sitä huonompi tehokkuus.
Normaalifaasi HPLC:
Käänteisfaasi HPLC:
Päättymissuoja - oksastamattomien sorbenttikohtien suojaaminen ylimääräisellä oksastuksella "pienillä" molekyyleillä. Hydrofobinen päätypinnoite (C1, C2): korkeampi selektiivisyys, huonompi kostuvuus; hydrofiilinen päätepäällyste (dioli): pienempi selektiivisyys, parempi kostuvuus.