DNA-merkki

DNA-markkerit (DNA-markkerit) tai molekyyligeneettiset markkerit ovat molekyylibiologisilla menetelmillä havaittu polymorfinen ominaisuus tietyn geenin tai minkä tahansa muun kromosomin osan DNA - nukleotidisekvenssin tasolla verrattaessa eri yksilöiden, rotujen genotyyppejä. , lajikkeet, linjat.

Viime vuosina on kertynyt paljon tietoa molekyyligeneettisten markkerien käytön tehokkuudesta sekä proteiinien että DNA :n , RNA :n tasolla , monien genetiikan, jalostuksen, luonnon monimuotoisuuden säilyttämisen ongelmien ratkaisemisessa, evoluution mekanismien tutkimisessa, kromosomikartoitukseen sekä siementen tuotantoon ja jalostukseen.

Yleisimmin käytetyt molekyyligeneettiset markkerit voidaan jakaa ehdollisesti seuraaviin tyyppeihin - proteiinien aminohapposekvenssejä koodaavien rakennegeenien osien markkerit (proteiinien elektroforeettiset variantit ), rakennegeenien ei-koodaavien osien markkerit ja erilaisten DNA:n markkerit sekvenssit, joiden suhdetta rakennegeeneihin ei yleensä tunneta - lyhyiden toistojen jakautuminen koko genomissa ( RAPD  - satunnaisesti monistettu polymorfinen DNA; ISSR  - käänteiset toistot; AFLP  - restriktiokohdan polymorfismi ) ja mikrosatelliittilokukset ( tandemtoistot alkeisyksikön kanssa pituus 2-6 nukleotidia).

DNA-tason polymorfismin havaitsemiseksi on olemassa useita nykyaikaisia ​​tekniikoita, joista voidaan erottaa seuraavat:

• restriktio - DNA-fragmentin pituuspolymorfismianalyysi (RFLP);
• polymorfismianalyysi käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR) ja muita menetelmiä, jotka perustuvat DNA:n monistukseen genomisen DNA: n toistuvien sekvenssien välillä.

DNA-koettimiin perustuvat markkerit

• RFLP (RFLP-markkerit, " restriktiofragmentin pituuspolymorfismista "). Polymorfismin arviointi restriktiivisten DNA-fragmenttien pituuksissa voidaan suorittaa eri tavoin, mutta perinteisin menetelmä on blot-hybridisaatio) [1] . Tämä menetelmä sisältää DNA:n eristämisen, restriktiofragmenttien saamisen, niiden elektroforeettisen erottamisen, siirtämisen suodattimille, mitä seuraa spesifisten DNA-koettimien hybridisaatio saatujen DNA-fragmenttien kanssa. DNA-koetin on suhteellisen lyhyt kloonatun DNA:n sekvenssi, jolla on tietty homologiataso ja kyky hybridisoitua genomisen DNA:n vastaavan alueen kanssa. Restriktioentsyymien ja koettimien yhdistelmät antavat erittäin toistettavat polymorfiset spektrit DNA-fragmenteista, jotka ovat spesifisiä kullekin yksilölle. Viimeksi mainittujen väliset erot voivat johtua esimerkiksi mutaatioista, jotka muuttavat restriktiokohtaa. RFLP:llä on useita tärkeitä etuja, mukaan lukien spektrien korkea toistettavuus eri laboratorioissa, markkerin yhteisdominoiva "käyttäytyminen". RFLP on tehokas genomikartoituksessa ja merkitsee geenejä monille biologisille ja taloudellisesti tärkeille piirteille.
• VNTR ( englanniksi  Variable Number Tandem Repeat ) on menetelmä nimeltä DNA-sormenjäljet ​​("sormenjäljet") [2] . Tandem-toistot ovat laajalti jakautuneita eri genomeissa ja ovat erittäin polymorfisia. Näiden DNA-alueiden suuren vaihtelevuuden seurauksena RFLP-analyysi mikro- ja minisatelliittisekvenssien koettimilla mahdollistaa korkearesoluutioisten monilokusten spektrien saamisen populaatiotasolla. Erittäin korkean polymorfismin vuoksi tämä lähestymistapa on tällä hetkellä hyvä työkalu populaation sisäisen ja interpopulaation vaihtelevuuden analysointiin sekä organismiryhmien välisten geneettisten etäisyyksien määrittämiseen. VNTR-alleeliset variantit periytyvät kodominanttisesti.

PCR-markkerit

Polymeraasiketjureaktio ( PCR) -menetelmä sisältää spesifisten alukkeiden käytön ja erillisen DNA:n monistustuotteiden tuotannon genomisen DNA:n yksittäisistä osista. Suuri joukko vastaavia teknologioita on rakennettu tälle periaatteelle. Yleisimmin käytetty RAPD-tekniikka perustuu monistettujen polymorfisten DNA-fragmenttien analyysiin käyttämällä yksittäisiä alukkeita, joilla on mielivaltainen nukleotidisekvenssi [3] , [4] , [5] .

• SSR ( englanniksi  Simple Sequence Repeats ) - Lyhyen mini- tai mikrosatelliittitoiston vierekkäisten alukkeiden PCR mahdollistaa kodominanttiperinnön omaavien markkerien tunnistamisen ja on siten kätevä heterotsygoottien tunnistamiseen tietylle lokukselle. Yksi pari PCR-kylkialukkeita sallii kuitenkin vain yhden lokuspolymorfismin huomioon ottamisen. Monille mikrosatelliittilokuksille polymorfismia ei ole mahdollista havaita. Tietyn mikrosatelliitin lokuksen reunustavat sekvenssit ovat yleensä lajikohtaisia.
• RAPD ( random Amplified Polymorphic DNA ) on  polymeraasiketjureaktio, jossa käytetään yhtä lyhyttä (yleensä 10-meeristä) aluketta, jolla on mielivaltainen nukleotidisekvenssi [6] , [7] . Alukesekvenssi ei ole täysin mielivaltainen, vaan sitä rajoittavat GC-koostumuksen arvot 40-70% ja nukleotidisekvenssin kielellinen monimutkaisuus 50-100%. RAPD:ssä voidaan käyttää yhtä aluketta tai useita RAPD-alukkeita. RAPD-tuote muodostetaan monistamalla genominen DNA-fragmentti, jota reunustaa käytetyn alukkeen käänteinen sekvenssi. Menetelmä on universaali eri lajien tutkimuksiin samoilla alukkeilla. Yleensä aluke, jolla on korkea polymorfismi yhdessä lajissa, on tehokas myös muissa lajeissa.
• ISSR ( Inter Simple Sequence Repeats ) [8] [9] on   erikoistunut versio RAPD-menetelmästä, jossa aluke koostuu mikrosatelliittisekvenssistä. Tämä menetelmä, kuten RAPD, käyttää yhtä tai useampaa 15-24 nukleotidin pituista aluketta. Mutta tässä tapauksessa alukkeet koostuvat tandemlyhyistä 2-4 nukleotidin toistoista, esimerkiksi 5'- CA CA CA CA CA CA CA CA CA G , ja yhdestä tai kahdesta selektiivisestä nukleotidista alukkeen 3'-päässä. ISSR:n monistustuotteet sisältävät käänteisen mikrosatelliittialukesekvenssin kyljillä. Koska tässä menetelmässä alukesekvenssi on spesifinen ja tiukemmin valittu kuin RAPD:ssä, PCR-pariutus voidaan suorittaa korkeammassa lämpötilassa (55-60°C) kuin RAPD-menetelmässä, ja siksi sormenjälki on yleensä paremmin toistettavissa.
• AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) [10]  on teknologia, joka on RFLP- ja PCR-menetelmien yhdistelmä .  AFLP on monimutkainen menetelmä, joka koostuu useista vaiheista: genomista DNA:ta rajoittaa samanaikaisesti kaksi restriktioendonukleaasia ( EcoRI ja MseI ), jotka tunnistavat vastaavasti 4 ja 6 emästä, mikä johtaa fragmentteihin, joissa on ulkonevat 3'-päät. Rajoitettu genominen DNA ligoidaan sitten adapteriin, joka sisältää "tahmeat" päät restriktiokohtia varten ( EcoRI ja Msel ). Sen jälkeen suoritetaan kaksi peräkkäistä PCR:ää. Ensimmäinen PCR (esiamplifikaatio) käyttää alukkeita, jotka ovat täysin komplementaarisia EcoRI- ja MseI-adapterien kanssa . Ensimmäisen PCR:n jälkeen EcoRI- ja MseI-adapterien väliin muodostuu suuri määrä monistustuotteita , joita on vaikea erottaa elektroforeesilla. Siksi toisessa PCR:ssä alukkeet, joissa on adapterit EcoRI ja Msel , sisältävät 3'-päässä ylimääräisiä ja ei-komplementaarisia adaptereita 1 - 3 emästä selektiivistä monistamista varten. DNA-fragmenttien erottaminen suoritetaan polyakryyliamidigeelissä, jossa on vastaavasti radioaktiivinen tai fluoresoiva leima.
• SSAP ( Sequence Specific Amplification Polymorphism ) [11] oli  muunnos AFLP -menetelmästä polymorfismin havaitsemiseksi sekä restriktiokohdassa että insertiokohdassa.[ kirkas ] transposonin tai retrotransposonin genomiseen DNA:han . Tutkittujen näytteiden genominen DNA pilkotaan restriktioentsyymeillä PstI ja MseI ja saadaan fragmentteja, joissa on ulkonevat 3'-päät. Rajoitettu DNA ligoidaan sitten PstI- ja Msel-adapteriin . Ensimmäinen polymeraasiketjureaktio (esiamplifikaatio) suoritetaan PstI- ja MseI-adapterien alukkeilla , toisin sanoen näiden adapterien kaikki mahdolliset yhdistelmät rajoitetussa genomisessa DNA:ssa monistetaan. Ensimmäisen PCR:n jälkeen muodostuu suuri määrä DNA-fragmenttien monistustuotteita, jotka sijaitsevat alukkeiden ja adapterien välissä. PCR-tuotteet laimennetaan ja niitä käytetään toiseen, selektiiviseen PCR:ään. Toinen PCR suoritetaan leimatulla LTR - alukkeella ja millä tahansa adapterialukkeella, joko Pstl :llä tai Msel :llä . Toisessa PCR:ssä voidaan käyttää adapteriin alukkeita, joissa on lisänukleotideja 3'-päässä, esimerkiksi yksi, kaksi tai kolme nukleotidia, jotka eivät ole komplementaarisia adapterille. Elektroforeesi toisen PCR:n jälkeen suoritetaan polyakryyliamidigeelissä tai sekvensserissä, jos käytettiin fluoresoivaa leimaa. Monistustuotteet muodostuvat toisen PCR:n jälkeen retrotransposonin LTR-sekvenssin ja adapterin välisen DNA-fragmentin monistumisen seurauksena. Amplifikaatiotuotteiden saaminen vain LTR-sekvenssien välillä on pohjimmiltaan mahdollista, mutta pääsääntöisesti kahden retrotransposonin välinen etäisyys on pidempi kuin tavallisesti hankittujen PCR-tuotteiden koot (2500–3000 emäsparia). Ja sovittimien välisiä vahvistustuotteita ei havaita, koska käytetään vain LTR-alukkeen etikettiä.
• IRAP - arkistokopio , joka on päivätty 30. lokakuuta  2016 Wayback Machinessa  ( Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism ) [12] [13] on kahden vierekkäisen retrotransposonin LTR  :n sekvensseille komplementaaristen alukkeiden välinen polymeraasiketjureaktio. Menetelmällä on useita vaihtoehtoja. IRAP:n ensimmäinen versio käyttää yhtä LTR:n aluketta. Amplifikaatiotuotteet muodostuvat kahden käänteisen LTR:n väliin, joilla on sama sekvenssi, eli yhdessä juosteessa yhden LTR:n 5'-pää on suunnattu toisen LTR:n 3'-päätä kohti. Jos retrotransposonin keskusosa on pidempi kuin PCR-tuotteiden tavanomainen koko (noin 3000 emäsparia), PCR suoritetaan vain kahden LTR:n välillä eri retrotranspositioista. Tässä tapauksessa viereiset LTR:t on käännettävä. Toinen IRAP-versio käyttää kahta erilaista aluketta käänteisissä LTR:issä: yksi aluke LTR:n 5'-päässä ja toinen 3'-päässä, suunnattu poispäin retrotransposonista. Tässä tapauksessa vierekkäiset LTR:t on järjestetty suoriksi pitkiksi toistoiksi. Ja lopuksi, IRAP:n kolmannessa versiossa käytetään LTR-alukkeita erilaisista retrotraposoneista eri suunnassa. Voit yhdistää LTR:n alukkeita muihin toistuvasta DNA:sta peräisin oleviin alukkeisiin.
• REMAP ( Retrotransposone  Microsatellite Amplified Polymorphism ) [12] [13]  on polymeraasiketjureaktio retrotransposonin LTR -fragmentin alukkeen ja läheisen, yksinkertaisen mikrosatelliittitoiston (ISSR-alukkeen) välillä. Tässä tapauksessa monistetun retrotransposonifragmentin asema "ankkuroidaan" käyttämällä aluketta mikrosatelliitin lokukseen. Esimerkiksi kasveissa on kätevää käyttää LTR-aluketta ja mikrosatelliittialuketta (5'-CACACACACACACACACACAG ) , jossa on yksi selektiivinen nukleotidi alukkeen 3'-päässä. REMAP käyttää LTR-alukevariantteja sekä LTR:n 5'- että 3'-päässä, kuten IRAPissa.
• RBIP ( Retrotransposon -Based  Insertion Polymorphisms ) [14]  on menetelmä, joka perustuu retrotransposonisekvenssien alukkeiden käyttöön ja kodominanttien alleelivarianttien paljastamiseen. Sen periaate perustuu monilokusiseen PCR:ään, joka käyttää alukeparia DNA-alueen vieressä ennen retrotranspositiota ja aluketta retrotransposonin LTR : ään, joka insertoidaan tälle alueelle kahden ensimmäisen alukkeen väliin. PCR:n tuloksena yksi alukeparin reunustamien fragmenttien varianteista monistuu, koska LTR:ien välinen sekvenssi on liian pitkä PCR:lle genomisen DNA-kohtien välillä, joissa on retrotransposoni sisällä. Tämä menetelmä havaitsee polymorfismin vain tietylle polymorfiselle lokukselle. Sen etuja ovat polymorfisten varianttien yhteisdominanssi, mahdollisuus käyttää suurta määrää lajikkeita dot-blot-analyysiin.
• iPBS ( inter PBS amplification ) [15]  on menetelmä, joka perustuu alukkeiden käyttöön PBS:n (alukkeen sitomiskohdan ) retrotransposonisekvenssien varalta .  Menetelmä on tehokas näytteiden välisen polymorfismin havaitsemiseen sekä uusien retrotransposonien kloonaamiseen eukaryooteissa . 
• Yhden nukleotidin polymorfismi (SNP).

Muistiinpanot

1. ↑ Southern EM Spesifisten sekvenssien havaitseminen geelielektroforeesilla erotettujen DNA-fragmenttien joukossa  // J  Mol Biol : päiväkirja. - 1974. - Voi. 98 , ei. 3 . - s. 503-517 . - doi : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 .
2. ↑ Jeffreys AJ, Wilson V., Thein SW Hypervariable 'minisatelliitti' alueet ihmisen DNA:ssa   // Nature . - 1984. - Voi. 314 . - s. 67-73 . - doi : 10.1038/314067a0 .
3. ↑ Kalendar R. Retrotransposonipohjaisten molekyylimarkkerien käyttö geneettisen monimuotoisuuden analysointiin  //  Field and Vegetable Crops Research: Journal. - 2011. - Vol. 48 , no. 2 . - s. 261-274 . - doi : 10.5937/ratpov1102261K .
4. ↑ Kalendar R., Flavell A., Ellis THN, Sjakste T., Moisy C., Schulman AH Kasvien monimuotoisuuden analyysi retrotransposonipohjaisilla molekyylimarkkereilla  //  Perinnöllisyys : Journal. - 2011. - Vol. 106 . - s. 520-530 . - doi : 10.1038/hdy.2010.93 .
5. ↑ Kalenteri R.N., Glazko V.I. Molekyyligeneettisten markkerien tyypit ja niiden käyttö  // Viljeltyjen kasvien fysiologia ja biokemia: lehti. - 2002. - T. 34 , nro 4 . - S. 141-156 .  (Venäjän kieli) (linkki ei saatavilla)
6. ↑ Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV mielivaltaisilla alukkeilla monistetut DNA-polymorfismit ovat hyödyllisiä geneettisinä markkereina  //  Nucleic Acids Research : päiväkirja. - 1990. - Voi. 18 , ei. 22 . - P. 6531-6535 . doi : 10.1093 / nar/18.22.6531 .
7. ↑ Welsh J., McClelland M. Sormenjälkien ottaminen genomeista käyttämällä PCR:ää mielivaltaisilla alukkeilla  //  Nucleic Acids Research : päiväkirja. - 1990. - Voi. 18 . - P. 7213-7218 . doi : 10.1093 / nar/18.24.7213 .
8. ↑ Sivolap Yu.M., Calendar R.N., Chebotar S.V. Viljakasvien geneettinen polymorfismi käyttämällä PCR:ää mielivaltaisilla alukkeilla  // Tsitol Genet. : Journal. - 1994. - T. 28 . - S. 54-61 . (Venäjän kieli)
9. ↑ Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genomin sormenjäljet ​​yksinkertaisella sekvenssitoistolla (SSR ) -ankkuroidulla polymeraasiketjureaktion amplifikaatiolla   // Genomics  : Journal. - Academic Press , 1994. - Voi. 20 , ei. 2 . - s. 176-183 . doi : 10.1006 / geno.1994.1151 .
10. ↑ Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., et ai. AFLP: uusi tekniikka DNA-sormenjälkien ottamiseen  //  Nucleic Acids Research : päiväkirja. - 1995. - Voi. 23 . - P. 4407-4414 . doi : 10.1093 / nar/23.21.4407 .
11. ↑ Waugh R., McLean K., Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A., ​​​​Thomas BB, Powell W. Bare-1:n kaltaisten retrotransposoituvien elementtien geneettinen jakautuminen ohran genomissa, joka paljastettiin sekvenssispesifisten monistuspolymorfismien avulla (S -SAP )  (englanti)  // Molecular General Genetics: Journal. - 1997. - Voi. 253 , no. 6 . - s. 687-694 . - doi : 10.1007/s004380050372 .
12. ↑ 1 2 Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A., Schulman AH IRAP ja REMAP: Kaksi uutta retrotransposonipohjaista DNA-sormenjälkitekniikkaa   // Theoretical and Applied Genetics : päiväkirja. - 1999. - Voi. 98 . - s. 704-711 . - doi : 10.1007/s001220051124 .
13. ↑ 1 2 Kalendar R., Schulman AH IRAP ja REMAP retrotransposonipohjaiseen genotyypitykseen ja sormenjälkien määritykseen   // Nature Protocols : päiväkirja. - 2006. - Voi. 1 , ei. 5 . - P. 2478-2484 . - doi : 10.1038/nprot.2006.377 .
14. ↑ Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis THN. Retrotransposonipohjaiset insertiopolymorfismit (RBIP) korkean suorituskyvyn markkerianalyysiin  //  The Plant Journal : päiväkirja. - 1998. - Voi. 16 , ei. 5 . - s. 643-650 . - doi : 10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x .
15. ↑ Kalendar R., Antonius K., Smykal P., Schulman AH  iPBS : Universaali menetelmä DNA-sormenjälkien ottamiseen ja retrotransposonieristykseen  // Teoreettinen ja sovellettu genetiikka : päiväkirja. - 2010. - Vol. 121 , nro. 8 . - s. 1419-1430 . - doi : 10.1007/s00122-010-1398-2 .