Golden Gate -kokoonpano , myös Golden Gate -kloonaus , on DNA-kloonausmenetelmä , jonka avulla voit koota useita DNA -fragmentteja samanaikaisesti ja järjestyksessä yhdeksi käyttämällä tyypin IIs restriktioendonukleaaseja ja bakteriofagi T4 DNA-ligaasia [1] [2] . Molekyylin kokoaminen suoritetaan in vitro . Yleisimmin käytettyjä tyypin IIs restriktioendonukleaaseja ovat BsaI, BsmBI ja BbsI.
Toisin kuin yleisimmät restriktaasit, kuten EcoRI ja BamHI , Golden Gateen käytetyt restriktioentsyymit pystyvät leikkaamaan DNA :ta tunnistuskohdan ulkopuolella ja siten luomaan ei-palindromisia tahmeita päitä [3] . Koska on mahdollista saada mikä tahansa 256 erilaisesta tahmeiden päiden muunnelmista, joiden pituus on 4 emäsparia , on mahdollista koota DNA-molekyyli suuresta määrästä fragmentteja käyttämällä tahmeiden päiden yhdistelmiä [3] . Käytännössä tämä tarkoittaa, että Golden Gate -sekvenssi on käytännössä saumaton. Lisäksi koska synteesituotteen sekvenssissä ei ole restriktioentsyymin tunnistuskohtaa , kun se on koottu oikein, restriktioentsyymit eivät voi leikata sitä uudelleen . Tämä tarkoittaa, että reaktiosta tulee käytännössä peruuttamaton [3] .
Tavallinen Cyler - protokolla määrittää lämpötilan vaihtelut 16 °C:sta (optimaalinen ligaaseille) 37 °C:seen (optimaalinen restriktioentsyymeille) [4] . Tätä synteesimenetelmää voidaan käyttää sekä yksittäiseen saumattomaan insertioon että useiden DNA-fragmenttien kokoamiseen yhteen putkeen [5] .
Sekvenssejä, jotka sisältävät "saumoja" (jälkiä kloonausjärjestelmien käytöstä), muodostuu usein suuren fragmenttimäärän kokoamisen seurauksena. Esimerkiksi Gateway -monisegmenttien kokoamismenetelmässä DNA-fragmentteja lisätään luovuttajafragmenttiin yhdessä ylimääräisten att -sekvenssien kanssa , jotka sopivat yhteen vierekkäisissä segmenteissä. Tämä johtaa siihen, että lopputuotteessa DNA-fragmentit erotetaan toisistaan att -sekvenssien avulla [6] . BioBrick- kokoonpanossa plasmidiin lisättyjen DNA-fragmenttien väliin jää kahdeksan nukleotidin "sauma", joka koodaa tyrosiinia ja lopetuskodonia [6] .
Golden Gate -synteesissä käytetään tyypin IIs restriktioentsyymejä , jotka leikkaavat DNA-sekvenssin tunnistuskohdan ulkopuolella [6] . Sama tyypin IIs-restriktioentsyymi voi luoda erilaisia tahmeita päitä eri DNA-sekvensseille. Erityisesti käyttämällä Bsal-entsyymiä on teoriassa mahdollista saada kukin tahmeiden päiden 256 variantista (pituus 4 bp) vastaavien DNA-fragmenttien läsnä ollessa [6] . Tahmeiden päätyosien oikealla synteesillä nämä palaset yhdistetään ilman "saumoja" osien välillä. Joissakin tapauksissa lopputuote voi olla ehdollisesti saumaton - restriktioentsyymin tunnistuskohdat voidaan jättää luovuttajan DNA:n monifragmentti-insertin molemmille puolille koko fragmentin leikkaamiseksi seuraavissa vaiheissa [6] . Koska ylimääräisiä DNA-fragmentteja voidaan insertoida vektoreihin ilman "saumoja" avoimen lukukehyksen sisällä , Golden Gate -menetelmää käytetään laajalti proteiinitekniikassa [6] .
Vaikka Golden Gate -synteesi nopeuttaa monisegmenttien kokoonpanoa, on hyödyllistä käyttää erityisiä plasmidiarkkitehtuureja saannon lisäämiseksi [5] . Jokaisessa vaiheessa Golden Gate -menetelmä pystyy kokoamaan jopa yhdeksän DNA-fragmenttia. Tämä edellyttää, että yhdistettävien vierekkäisten DNA-fragmenttien tahmeat päät ovat homologisia keskenään, eikä restriktioentsyymin tunnistuskohtia tulisi sisällyttää leikattuihin fragmentteihin [5] . Kun fragmentit on ligatoitu bakteriofagin T4 DNA-ligaasilla, tuote ei sisällä restriktioentsyymin IIS-tunnistuskohtia eikä sitä leikata uudelleen reaktion myöhemmässä kulussa [5] . Ligaamattomat kohdat puolestaan voivat olla vuorovaikutuksessa restriktioentsyymin kanssa, mikä lisää fragmentteja reaktioseokseen [5] . Oikealla kokeen asetuksella ja DNA-fragmenttien valinnalla voidaan saada lineaarinen tuote yhdessä syklissä [5] .
DNA-sekvenssin restriktioentsyymikokoonpanoa säätelevät erilaiset kloonausstandardit kloonaustehokkuuden hajoamisen ja plasmidin toiminnan häiriintymisen minimoimiseksi. Tällaisia vaikutuksia voi aiheuttaa virheellinen kokoonpano, esimerkiksi jos insertissä tai vektorissa on tahattomia restriktiokohtia [7] .
Golden Gaten kloonauksessa on kaksi vaihetta [7] . Ensimmäisessä vaiheessa kootaan monogeeninen sekvenssi sellaisista elementeistä kuin promoottori , avoimet lukukehykset ja terminaattori [7] . Sen jälkeen kokoonpanon toisessa vaiheessa yhdistetään useita ensimmäisessä vaiheessa saatuja monogeenisiä sekvenssejä [7] . Golden Gate -kokoonpanon toteuttamiseksi, joka koostuu kahdesta tai useammasta vaiheesta, käytetään MoClo- (modulaarinen kloonaus) ja GoldenBraid [7] -standardijärjestelmiä .
MoClo-standardi jakaa geneettiset elementit neljään eri tasoon:
MoClo käyttää rinnakkaista lähestymistapaa, jossa kaikissa tuloksena olevissa tason 0 moduuleissa on BpiI-restriktiokohdat insertin molemmilla puolilla. Vektorissa, johon geenit lisätään, on kaksi käänteistä Bsal-restriktioentsyymin tunnistuskohtaa ja niiden välissä leikattu valintamerkki. [7] Usein lacZ -geeni toimii sellaisena markkerina , joka mahdollistaa sellaisten plasmidien negatiivisen valinnan, joissa reportterigeeni on onnistuneesti korvattu kootulla DNA:lla [7] . Jokaisen tason 0 moduulin ja kohdevektorin tahmeiden päiden tulee olla komplementaarisia vain viereisen fragmentin tahmeiden päiden kanssa, ja tahmeiden päiden yhdistelmien sarja määrittää lopputuotteen arkkitehtuurin [7] . Golden Gate -rakennus alkaa yleensä tason 0 moduuleilla, jotka sisältävät yksittäisiä geenejä [5] . Ei-toivottujen restriktiokohtien tunnistamiseksi on tarpeen suorittaa tason 0 moduulien sekvensointi [5] . Jos tason 0 moduulit ovat kuitenkin liian suuria, kokoonpano on aloitettava tason −1 sarjoilla, jotka on myös järjestettävä [5] . Jos kokoonpano aloitettiin tason −1 fragmenteista, tason 0 moduuleja ei tarvitse sekvensoida uudelleen [5] .
Taso -1Tason −1 fragmentteja käytetään pitkien tason 0 moduulien kokoonpanossa [5] . Tällaisten fragmenttien saamiseksi ja kehittämiseksi käytetään tavallisesti tylppäpäisten sekvenssien ligaatiota ja sitä seuraavaa PCR :ää [5] . Kohdevektori ei saa sisältää restriktioentsyymiä tyyppi IIs, jota käytetään seuraavassa kokoamisvaiheessa [5] .
Taso 0Tason 0 moduulit ovat MoClo-järjestelmän selkäranka, koska ne sisältävät täydellisiä geneettisiä elementtejä, kuten promoottorin , 5'-kääntämättömän alueen (UTR) , proteiinia koodaavan sekvenssin ja terminaattorin [5] . Onnistuneen Golden Gate -kokoonpanon saavuttamiseksi tason 0 moduulien sisäiset sekvenssit eivät saa sisältää Bsal-, BpiI- ja Esp3I-restriktioentsyymin tunnistuskohtia IIs, vaan niitä täytyy reunustaa (eli reunustaa) kahdella käänteisessä suunnassa olevalla Bsal-restriktiokohdalla [5] .
Jos sekvensoinnin tuloksena havaitaan, että tason 0 moduuli sisältää ei-toivotun restriktiokohdan, se voidaan mutatoida in silico poistamalla tai korvaamalla yksi nukleotidi [5] . Samalla on varmistettava, että tuotu mutaatio ei vaikuta DNA:sta syntetisoidun tuotteen (yleensä RNA:n tai proteiinin) ominaisuuksiin [5] . Synonyymejä mutaatioita suositellaan sisällytettäväksi proteiinia koodaavaan sekvenssiin, koska ne eivät muuta syntetisoidun proteiinin sekvenssiä eivätkä siten vaikuta geenin toimintaan [5] .
Taso 1Tason 1 kohdevektori määrittää lisätyn konstruktin sijainnin ja suunnan [8] . Tällaisessa vektorissa valintamarkkerigeeniä ( lacZ ) reunustaa kaksi restriktiokohtaa kummallakin puolella. Tässä tapauksessa sisäinen kohta (BsaI) on käänteinen ja ulkoinen kohta (BpiI) sijaitsee suorassa suunnassa. Tason 1 vektorista on 14 muunnelmaa, jotka eroavat ulkoisten kohtien tahmeasta päätesekvenssistä, mutta eivät eroa sisäisten kohtien tahmeiden päätesekvenssien suhteen [8] . Siten oikein muodostettu joukko tason 0 moduuleja voidaan kloonata mihin tahansa näistä vektoreista [8] .
Tason 1 vektoreita käytetään lyhytaikaiseen ilmentymiseen Agrobacteriumin ohjaamissa kasveissa [8] .
Taso 2Tason 2 kohdevektoreissa on 2 käänteistä BpiI-restriktioentsyymin tunnistuskohtaa tason 1 moduulien liittämistä varten [8] . Vektorissa ennen insertiokohtaa olevan restriktiokohdan on oltava komplementaarinen kohtaan ennen geenin alkua tason 1 moduulissa, restriktiokohta insertiokohdan jälkeen on universaali [8] . Jokaisella kloonauksella vektoriin voidaan liittää 2-6 geeniä [8] .
Useamman geenin lisääminen yhdessä vaiheessa ei ole toivottavaa, koska se johtaa todennäköisesti virheellisiin tahmeapään yhdistelmiin johtuviin kokoonpanoihin [8] .
Siten yli 6 geenistä koostuvien konstruktien kokoaminen on suoritettava useissa vaiheissa. Tämä vaatii linkkerin päätesekvenssejä, jotka sisältävät Bsal- tai BsmBI-restriktioentsyymin tunnistuskohdat käänteisessä asennossa ja uuden valintamarkkerin (sinisen tai violetin) [8] . Jokaisessa vaiheessa on välttämätöntä vaihtaa restriktioentsyymi ja markkeri [8] . Kun seulotaan , pesäkkeet , jotka sisältävät oikein kootun vektorin, vaihtavat väriä jokaisessa kokoonpanovaiheessa (sinistä violettiin), mutta viimeisessä vaiheessa, kun käytetään sulkevan pään linkkeriä, pesäkkeiden väri on valkoinen [8] .
Taso MM-tason kohdevektorit ovat samanlaisia kuin tason 2 vektorit, paitsi että Bsal-paikka on ennen käänteisten BpiI-kohtien paria [9] . Kun yksi tai useampi geeni kloonataan M-tason vektoriin, lisätään toinen Bsal-restriktiokohta spesifisen (M) linkkerin päätesekvenssin kanssa. Tästä johtuen kaikki kootut geenit sisältävä fragmentti voidaan leikata pois ja käyttää kloonauksen seuraavassa vaiheessa (P-taso) [8] .
Taso PP-tason kohdevektorit ovat samanlaisia kuin M-tason, mutta BpiI-kohdat korvataan Bsal:llä ja Bsal-kohdat korvataan BpiI:llä. Useita M-tason rakenteita, joissa on yhteensopivat tahmeat päät, voidaan kloonata kohde-P-vektoriin yhdessä vaiheessa. Teoriassa on mahdollista koota jopa 36 geeniä yhdeksi konstruktiksi, kun suoritetaan 6 rinnakkaista M-tason reaktiota (kukin 6 geeniä), mutta käytännössä geenejä kootaan yleensä vähemmän, koska niin suuria rakenteita ei tarvita. useimmissa hankkeissa [8] . Tästä huolimatta M- ja P-tason vektorit on suunniteltu siten, että P-tason vektoriin kloonatut geenit voidaan edelleen kloonata M-tason vektoriin ja päinvastoin [8] .
Standardin Golden Gate -protokollan mukaan edellisessä kloonausvaiheessa käytetyt restriktiokohdat muuttuvat saavuttamattomiksi [10] . Yli 6 geenin kokoaminen vaatii erilaisen tyypin IIs restriktioentsyymin ja sen vastaavien tunnistuskohtien lisäämisen [10] . Tämä voidaan tehdä tason 2 vektoreilla tai M- ja P-tasoilla. GoldenBraid tarjoaa muunnelman M- ja P-tason järjestelmästä.
GoldenBraid-menetelmän mukaiseen kloonaukseen käytetään 4 plasmidin järjestelmää, jotka pystyvät muodostamaan kaksoissilmukan (niin sanotut "seppeleet" - "punos"). Tällainen järjestelmä mahdollistaa useiden rakenteiden binäärikokoonpanon kerralla [10] .
Golden Gate -kokoonpanomenetelmää voidaan käyttää myös mutageneesin (Golden Mutagenesis) suorittamiseen. Tätä tekniikkaa on helppo soveltaa online-alukkeiden valintatyökalujen ( GoldenMutagenesis web tool ) ja vektoreiden [11] ansiosta .