Sisäkkäinen polymeraasiketjureaktio

Nested-polymeraasiketjureaktio ( englanniksi  nested PCR - "nested" PCR) on PCR  :n kaksivaiheinen muunnelma , jota käytetään vähentämään epäspesifisten reaktiotuotteiden määrää [1] . Ensimmäisessä vaiheessa monistetaan alue , joka sisältää kohde- DNA -fragmentin ja sen reunustavat sekvenssit (eli sijaitsevat fragmentin reunoilla), joihin ensimmäinen alukepari kiinnitetään . Toisessa vaiheessa lisätään alukkeita, jotka ovat komplementaarisiakohdefragmentin päät. Koska ensimmäisen vaiheen tuote sisältää kohdefragmentin (eli lopputuotteen ensimmäisen vaiheen tuotteen sisällä), tätä PCR-variaatiota kutsutaan sisäkkäiksi [1] .

Polymeraasiketjureaktio

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on DNA:n monistusprosessi, jossa käytetään DNA-riippuvaista DNA-polymeraasientsyymiä . Tällainen reaktio on löytänyt laajan sovelluksen geneettisissä laboratorioissa tietyn DNA- tai RNA -osan läsnäolon havaitsemiseksi näytteissä (toisessa tapauksessa on välttämätöntä ensin muuntaa RNA DNA:ksi käänteistranskriptioreaktiolla ). Myös PCR:ää käytetään geenitekniikassa tarvittavan fragmentin saamiseksi ja sen jatkokäyttöön kloonauksessa , in vitro -transkriptiossa ja muihin tarkoituksiin. Tärkeä vaihe reaktion valmistuksessa on kohdefragmentin päissä pariutuvien alukkeiden valinta. Tässä tapauksessa alukkeet kiinnittyvät usein myös muihin DNA-alueisiin, mikä johtaa tuotteiden sekoitukseen. Tämän tapahtumisen todennäköisyys kasvaa PCR-syklien määrän myötä [1] .

Pohjusteet

Nested PCR käyttää kahta paria alukkeita, jotka on lisätty kahdessa peräkkäisessä reaktiovaiheessa. Ensimmäistä paria kutsutaan ulkoiseksi ja se palvelee kohde-DNA-fragmentin sisältävän kohdan alkuperäistä monistusta, kun taas tässä vaiheessa käytetään pientä määrää lämpötilasyklejä (15 - 30). Toinen pari, jota kutsutaan sisäiseksi, hehkutetaan ensimmäisen tuotteeseen ja sitä käytetään PCR:n toisessa vaiheessa suurella määrällä lämpötilasyklejä. Koska kohdefragmentin sisältävän DNA:n määrä kasvaa eksponentiaalisesti ensimmäisen vaiheen jälkeen ja jokaisessa vaiheessa käytetyt alukkeet ovat komplementaarisia eri sekvenssien kanssa kohde-DNA-alueen ympärillä, tuloksena oleva reaktion spesifisyys kasvaa. Tätä lähestymistapaa käytetään usein saadakseen harvinaisia ​​fragmentteja tai vähän monimutkaisia ​​alueita (esimerkiksi runsaasti GC:tä sisältäviä sekvenssejä) [2] .

Reaktiovaiheet ja protokolla

Kamolvarin ja kollegat kuvasivat sisäkkäisen PCR-protokollan ensimmäisen kerran vuonna 1993 rabiesin diagnosoimiseksi [ 3] . Sen jälkeen toimintojen järjestys on pysynyt käytännössä muuttumattomana [4] . Artikkelin alkuperäinen protokolla on kuvattu alla.

Ensimmäinen vaihe

RNA:n eristämisen jälkeen suoritettiin käänteistranskriptio käyttämällä 50 pmol kutakin ulkoisten alukkeiden paria 1 µg materiaalia kohti. Seos, joka sisälsi RNA/ cDNA - fuusion ja alukkeet, täytettiin sitten 50 ul:ksi PCR-puskurilla, joka sisälsi 1,25 U. Taq-DNA-polymeraasi ja 62,5 µmol/l dDNP ( deoksiribonukleosiditrifosfaatti ). 50 µl mineraaliöljyä kerrostettiin seoksen päälle ja suoritettiin 30 PCR-sykliä (94 °C, 1 min (sulatus); 45 °C, 2 min (hehkutus); 72 °C, 2,5 min (venymä)) [ 3] .

Ensimmäisessä vaiheessa käytetään tämän fragmentin monistamiseen ulompaa alukeparia, joka on komplementaarinen kohde-DNA-fragmentin ympärillä oleville alueille. Kohdekohdan lisäksi alukkeet voivat liittyä myös muihin kohtiin. Ensimmäisen vaiheen tuotteiden lopullinen seos sisältää sekä kohde-DNA:ta että epäpuhtauksia [3] .

Toinen vaihe

Nested PCR:n toista vaihetta varten otettiin 2 µl:n alikvootti ensimmäisestä seoksesta ja lisättiin 23 µl:aan seosta, joka sisälsi 20 pmol sisäisiä alukkeita, jotka olivat komplementaarisia itse kohdefragmentin alueille, 25 mmol/l dDNF:ää ja 1 yksikkö Taq DNA -polymeraasia. Käytti 30 vahvistussykliä samalla ohjelmalla kuin ensimmäisessä vaiheessa [3] .

Tässä tapauksessa todennäköisyys alukkeen pariutumisesta muihin ensimmäisen vaiheen tuotteisiin on erittäin pieni, ja useimmissa tapauksissa vain kohde-DNA-fragmentti monistuu [2] [3] .

Käyttöesimerkkejä

Nested PCR:ää käytetään laajalti tehtävissä, jotka vaativat suurta spesifisyyttä, kuten: testijärjestelmät [5] , työskentely pienten materiaalimäärien kanssa [6] , DNA-näytteiden puhdistaminen jatkoanalyysiä ja käyttöä varten [7] .

Sisäkkäisen PCR:n erityisiä käyttötapauksia:

Muistiinpanot

  1. ↑ 1 2 3 Shen Chang-Hui. Nukleiinihappojen monistus  (englanniksi)  // Diagnostinen molekyylibiologia. - 2019. - s. 215-247 . — ISBN 9780128028230 . - doi : 10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2 .
  2. ↑ 1 2 Haff L A. Parannettu kvantitatiivinen PCR käyttämällä sisäkkäisiä alukkeita.  (englanniksi)  // Genomitutkimus. - 1994. - 1. kesäkuuta ( nide 3 , nro 6 ). - s. 332-337 . — ISSN 1088-9051 . - doi : 10.1101/gr.3.6.332 .
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Kamolvarin N. , Tirawatnpong T. , Rattanasiwamoke R. , Tirawatnpong S. , Panpanich T. , Hemachudha T. Raivotaudin diagnoosi polymeraasiketjureaktiolla sisäkkäisillä alukkeilla  //  Journal of Infectious Diseas. - 1993. - 1. tammikuuta ( nide 167 , nro 1 ). - s. 207-210 . — ISSN 0022-1899 . - doi : 10.1093/infdis/167.1.207 .
  4. ↑ Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. PCR-monistuksen periaatteet ja tekniset näkökohdat . - [Dordrecht]: Springer, 2008. - 1 online-lähde (325 sivua) s. - ISBN 978-1-4020-6241-4 , 1-4020-6241-9, 978-1-4020-6240-7 281-24237-2.
  5. ↑ 1 2 Sun Yajuan , Chen Jiajun , Li Jia , Xu Yawei , Jin Hui , Xu Na , Yin Rui , Hu Guohua. Uusi lähestymistapa, joka perustuu yhden putken sisäkkäiseen PCR:ään ja lateraaliseen virtausliuskaan tuberkuloosin aivokalvontulehduksen erittäin herkkää diagnoosia varten  //  PLOS ONE. - 2017. - 30. lokakuuta ( osa 12 , nro 10 ). — P.e0186985 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0186985 .
  6. ↑ 1 2 Gallego Sandra , Mangano Andrea , Gastaldello René , Sen Luisa , Medeot Silvia. Nested-polymeraasiketjureaktion käyttökelpoisuus ihmisen T-solulymfotrooppisen viruksen tyypin I/II molekyylidiagnoosissa  //  Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. - 2004. - Kesäkuu ( nide 99 , nro 4 ). - s. 377-380 . — ISSN 0074-0276 . - doi : 10.1590/S0074-02762004000400006 .
  7. ↑ 1 2 Mamedov Ilgar Z. , Britanova Olga V. , Zvyagin Ivan V. , Turchaninova Maria A. , Bolotin Dmitriy A. , Putintseva Ekaterina V. , Lebedev Yuriy B. , Chudakov Dmitriy M. Preparing Unbiased T-Cell Receptor and Antibody Receptor and Antibody cDNA-kirjastot seuraavan sukupolven sekvensointiprofilointiin  //  Immunologian rajat. - 2013. - Vol. 4 . — ISSN 1664-3224 . - doi : 10.3389/fimmu.2013.00456 .
  8. ↑ Llop Pablo , Bonaterra Anna , Peñalver Javier , López María M. Erittäin herkän sisäkkäisen PCR-menetelmän kehittäminen käyttämällä yhtä suljettua putkea oireettoman Erwinia amylovorain -kasvimateriaalin havaitsemiseen  //  Sovellettu ja ympäristömikrobiologia. - 2000. - 1. toukokuuta ( nide 66 , nro 5 ). - s. 2071-2078 . — ISSN 1098-5336 . - doi : 10.1128/AEM.66.5.2071-2078.2000 .
  9. ↑ Yang Xue , Hameed Uzma , Zhang Ai-Fang , Zang Hao-Yu , Gu Chun-Yan , Chen Yu , Xu Yi-Liu. Nested-PCR-määrityksen kehittäminen Pilidiella granatin nopeaan havaitsemiseen granaattiomenahedelmissä  //  Tieteelliset raportit. - 2017. - 20. tammikuuta ( nide 7 , nro 1 ). — ISSN 2045-2322 . - doi : 10.1038/srep40954 .
  10. ↑ Guo Ping , Yu Yongxin , Pan Yingjie , Yan Shuling , Wang Yongjie. Sisäkkäisten PCR-alukkeiden suunnittelu ja arviointi genoryhmän I norovirusten spesifiseen havaitsemiseen ostereissa  //  Molecular and Cellular Probes. - 2018. - elokuu ( osa 40 ). - s. 40-43 . — ISSN 0890-8508 . - doi : 10.1016/j.mcp.2018.06.002 .
  11. ↑ Lin Chao , Ying Furong , Lai Yanan , Li Xiaolong , Xue Xiangyang , Zhou Tieli , Hu Dongwei. Sisäkkäisen PCR:n käyttö trikomonadien havaitsemiseen bronkoalveolaarisessa huuhtelunesteessä  (englanniksi)  // BMC Infectious Diseases. - 2019. - 10. kesäkuuta ( osa 19 , nro 1 ). — ISSN 1471-2334 . - doi : 10.1186/s12879-019-4118-9 .
  Siirry Wikidata-kohteeseen  Sanakirjat ja tietosanakirjat