Long-Term E. coli Evolution Experiment on ainutlaatuinen koe Escherichia coli -bakteerin evoluutiosta in vitro, jonka on suorittanut Richard Lenskyn johtama tiimi Michiganin yliopistossa . Kokeen aikana jäljitettiin geneettisiä muutoksia, jotka tapahtuivat 12 E. coli -populaatiossa yli 60 000 sukupolven aikana. Kokeilu alkoi 24. helmikuuta 1988 ja on jatkunut yli 30 vuotta [1] [2] .
Kokeen aikana havaittiin laaja valikoima geneettisiä muutoksia. Merkittävimmät mukautukset olivat kyky assimiloida natriumsitraattia , joka esiintyi yhdessä populaatioista , sekä polymorfisten yhteisöjen syntyminen jakamalla pesäke erillisiin rinnakkaiseloihin ja itsenäisesti kehittyviin populaatioihin.
Kokeen tarkoituksena oli löytää vastauksia joihinkin tärkeisiin evoluutiobiologian kysymyksiin [3] :
E. coli -bakteerin valinta selittyy tämän organismin nopealla sukupolvien vaihdolla ja genomin pienellä koosta, mikä mahdollistaa monimutkaisemmissa organismeissa vuosituhansia vievien prosessien tutkimisen lyhyessä ajassa. Koska tätä bakteeria on käytetty molekyylibiologiassa vuosikymmeniä, se on hyvin tutkittu, ja sen kanssa työskentelyyn liittyvät tekniikat ovat hyvin debuggoituja. Bakteeri voi pysyä jäädytettynä pitkään menettämättä elinkelpoisuutta, mikä mahdollistaa eräänlaisen "kokeen kroniikan" säilyttämisen, ja halutun sukupolven sulattaminen mahdollistaa tarvittaessa kokeen toistamisen mistä tahansa aiemmin tallennetusta pisteestä. .
Seymour Lederbergin vuonna 1966 kuvaama "Bc251-kanta" otettiin E. colin esi -isäkanta. [4] ja Bruce Levin käytti sitä bakteriologista ekologiaa koskevissa kokeissa vuonna 1972 . Tämän kannan tunnusomaisia piirteitä olivat T6 r (resistenssi bakteriofaagille T6), Str r (resistenssi streptomysiinille ), r − m − ( rajoitus- ja modifiointitoiminnot ovat estetty), Ara − (kyvyttömyys absorboida arabinoosia ) [5] . Ennen kokeen aloittamista Lenski valmisti ara - operonin pistemutaation avulla tästä kannasta Ara + -variantin , joka kykeni assimiloimaan arabinoosia.
Kokeen alussa luotiin 12 alkuperäisen kannan populaatiota (6 Ara + ja 6 Ara − populaatiota , jotka nimettiin A+1 … A+6 ja A−1 … A−6). Geneettisiä markkereita käytettiin tunnistamaan tarkasti jokainen populaatio. Jokainen populaatio lisääntyi keinotekoisessa ympäristössä, jossa stressiolosuhteet (pääruokatuotteen - glukoosin puute) rajoittivat lisääntymisnopeutta . Joka päivä 0,1 ml kunkin putken sisällöstä siirrettiin putkeen, jossa oli 10 ml tuoretta ravintoalustaa, jossa bakteerit jatkoivat kasvuaan. Joka 500. sukupolvi (vastaa 75 päivän aikaväliä ) jäädytettiin glyseroliin -80 °C:ssa , jotta tulevaisuudessa uusien analyysimenetelmien myötä olisi mahdollista suorittaa yksityiskohtaisempi tutkimus. Kokeen aikana esi-isäkannan genomi sekvensoitiin kokonaan, samoin kuin joidenkin vaiheiden sukupolvien genomit (sukupolvet 2000 , 5000 , 10000 , 15000 , 20000 ja 40000 ) [6] .
Koska E. colin genomin koko on 4,6 miljoonaa emäsparia, havaitulla mutaationopeudella (noin 1000 emäsparin muutosta päivässä) jokainen emäspari genomissa korvataan keskimäärin useammin kuin kerran 20 vuodessa [7] . Kaikki genomissa esiintyvät mutaatiot eivät ole samanarvoisia. Mutaatioiden hyödyllisyys määräytyy niiden kantajien lisääntymisnopeuden mukaan. Lisääntynyt lisääntymisnopeus sallii mutatoituneen bakteerin syrjäyttää populaatiosta bakteerit, joissa on puuttuva mutaatio. Tässä tapauksessa mutaatio on "kiinteä" ja se on läsnä kaikkien seuraavien sukupolvien genomissa. Haitalliset mutaatiot toimivat päinvastoin. On myös "neutraaleja" mutaatioita, jotka eivät vaikuta bakteerien lisääntymisnopeuteen, koska niitä esiintyy genomin merkityksettömillä alueilla. Näitä mutaatioita ei kiinnitetä tai tukahdu valinnalla, joten ne ilmaantuvat ja katoavat satunnaisesti.
Kokeessa käytettiin E. coli -linjaa , joka lisääntyy yksinomaan fissiolla (ilman seksuaalista prosessia). Siten tutkittujen ilmiöiden valikoima rajoittui vasta syntyneisiin mutaatioihin [3] .
Kokeessa käytettiin Davisin minimaalista ravintoalustaa [8] , jonka glukoosipitoisuus oli 25 mg/l, jota kutsutaan nimellä DM25. Tämä väliaine tuottaa 50 miljoonaa bakteeria/ml stationäärifaasissa [9] .
Viljelytilavuus oli 10 ml . Viljelmiä pidettiin 50 ml: n erlenmeyerpulloissa , jotka oli löyhästi peitetty ylösalaisin olevilla lasidekantterilla. Inkubointi tapahtui 37 °C: n lämpötilassa ja pyörimisnopeudella 120 rpm . Päivän kuluttua 0,1 ml viljelmää siirrettiin pulloon, jossa oli 9,9 ml tuoretta alustaa.
DM25-alustan koostumus (500 ml:n injektiopulloa kohti) on seuraava:
Komponentti | Kaava | Äänenvoimakkuus | Paino | Ruoanlaitto |
---|---|---|---|---|
Kaliumvetyfosfaatti | K2HPO43H2O _ _ _ _ _ _ | 3,5 g | Valmista liuos ja autoklaavi | |
Kaliumdivetyfosfaatti | KH 2 PO 4 H 2 O | 1,0 g | ||
Ammoniumsulfaatti | ( NH4 ) 2SO4 _ _ | 0,5 g | ||
natriumsitraatti | Na3C6H5O7 _ _ _ _ _ _ _ | 0,25 g | ||
Vesi | H2O _ _ | 500 ml | ||
glukoosi (10 %) | C6H12O6 _ _ _ _ _ | 0,125 ml | 12,5 mg | Lisää autoklaavoinnin jälkeen steriileistä injektiopulloista |
Magnesiumsulfaatti (10 %) | MgSO4_ _ | 0,5 ml | 25 mg | |
Tiamiini (0,2 %) | C 12 H 17 N 4OS _ | 0,5 ml | 25 mg |
On huomattava, että normaalisti E. coli ei kuluta natriumsitraattia, vaan sitä käytetään vain raudan kelaatin muodostajana .
Paperi [2] esittelee A-1-populaatiotutkimuksen tulokset, yksi 12:sta kokeeseen osallistuneesta. Kirjoittajat jakavat väestön kehityksen kahteen vaiheeseen, joiden välinen raja osuu suunnilleen 26 000 sukupolveen.
Sekvensoitaessa 20 000 sukupolven genomia ja verrattaessa sitä alkuperäisen kannan genomiin löydettiin 45 erityyppistä kiinteää mutaatiota (nukleotidisubstituutiot, insertiot, substituutiot, inversiot, transposoituvien elementtien insertio), joista suurin osa (29) oli yhden nukleotidin substituutiot. Kiinteiden mutaatioiden kertymisnopeus kokeen ensimmäisen vaiheen aikana pysyi suunnilleen vakiona. Oli odottamatonta, että bakteerien sopeutumiskyky ympäristöön lisääntymisnopeudella ilmaistuna kasvoi erittäin nopeasti sukupolveen 1500 asti, sitten sen kasvu hidastui samalla mutaatioiden kiinnittymisnopeudella.
Muilla populaatioilla on alle 100 kiinteää mutaatiota ensimmäisen 20 000 sukupolven aikana, joista vain 10-20 on ollut hyödyllistä [3] .
Evoluutiomuutoksen malli A-1-populaatiossa muuttui dramaattisesti sukupolven 26 000 jälkeen. Tässä vaiheessa mutT -geenissä tapahtui mutaatio, joka koodaa DNA:n korjaukseen osallistuvaa proteiinia . Tämän seurauksena keskimääräinen kiinteiden mutaatioiden lukumäärä kasvoi dramaattisesti 0,05:een sukupolvea kohden (verrattuna 0,002:een ensimmäisessä vaiheessa). Yhteensä 609 mutaatiota kirjattiin sukupolvien 20 000–40 000 aikana. Samanlainen kasvu mutageneesin nopeudessa havaittiin kolmessa muussa populaatiossa 12:sta.
A-3-populaation evoluution tulos osoittautui odottamattomaksi. Sukupolvea 33127 vastaavana aikana pullossa havaittiin voimakas sameus, mikä osoitti bakteerien suurta tiheyttä. Samanlainen vaikutus havaittiin yleensä, kun viljelmä oli kontaminoitunut toisen lajin bakteereilla, jotka kuluttavat natriumsitraattia. Koska natriumsitraatin pitoisuus alustassa (500 mg/l) on 20 kertaa korkeampi kuin glukoosin pitoisuus (25 mg/l), sitraatin kulutus lisää merkittävästi solutiheyttä [7] .
E. colille tyypillinen piirre on kyvyttömyys ruokkia sitraatteja happiympäristössä . Tutkimus osoitti kuitenkin, että natriumsitraattia kuluttavat mutantit E. coli -bakteerit ( Cit + -bakteerit). Geneettisten markkerien sekä aiemmille A-3-sukupolville tyypillisten pykF- ja nadR-mutaatioiden todentaminen vahvisti, että Cit + -bakteereja ei tuotu ulkopuolelta, vaan ne olivat alkuperäisen kannan mutatoituneita yksilöitä [7] .
Pakastettujen näytteiden retrospektiivinen tutkimus osoitti, että Cit + -bakteereja ei ole lainkaan 31 000 sukupolvessa , 0,5 % 31 500 sukupolvessa ja 15 ja 19 % 32 000 ja 32 500 sukupolvessa. 33 000 sukupolvessa Cit + käytännössä katoaa (1,1 %), mutta 33 500 sukupolvessa ne myös odottamatta valtaavat asuintilansa ja hallitsevat täysin seuraavissa sukupolvissa. Tutkijat katsovat tämän johtuvan joidenkin vielä tunnistamattomien mutaatioiden ilmaantumisesta sukupolvien 33 000 ja 33 500 välillä , mikä yhdistettynä kykyyn ruokkia sitraatilla antoi Cit + -bakteereille evoluutioedun [7] .
Testattiin hypoteesia, että kyky assimiloida sitraattia (vaikkakin vähemmän tehokkaasti kuin glukoosilla) oli alun perin bakteereissa, mutta tämä ominaisuus ei ilmennyt selvästi ennen samanaikaisten mutaatioiden esiintymistä. Hypoteesia ei vahvistettu, koska bakteerit 31 000. sukupolveen asti eivät kyenneet lisääntymään ympäristössä, jossa ei ollut glukoosia [7] .
Vuoteen 2017 mennessä, kun kokeilu oli jatkunut 29 vuotta, havaittiin yllättäen, että 9 populaatiosta 12:sta oli tapahtunut ekologista monipuolistumista. Alkuperäinen monokulttuuri jakautui erillisiin populaatioihin, jotka jatkoivat kehitystään erikseen syrjäyttämättä toisiaan [10] [11] .
Kokeen lähtökohtana oli seurata bakteeriyhteisön kehitystä äärimmäisen yksinkertaisissa olosuhteissa - jatkuvassa ympäristössä, yhdellä ravintolähteellä, ilman geneettistä vaihtoa ja ekologista vuorovaikutusta organismien välillä. Ajan mittaan kuitenkin tapahtui väestön spontaani komplikaatio erillisten ekologisten markkinarakojen ilmaantuessa. Yksinkertaisin esimerkki tällaisesta erottelusta on kahden mikrobiyhteisön muodostuminen, joilla kullakin on omanlaisensa aineenvaihdunta, joissa käytetään toisen yhteisön jätetuotteita. Tämä vaikutus havaittiin ensimmäisen kerran vuonna 2014 yhdessä populaatioista (Ara-2) [12] ja vuoteen 2017 mennessä se havaittiin yhdeksässä populaatiossa 12:sta. Evoluutiota ei tapahdu koko populaation mittakaavassa, vaan jokaisessa populaatiossa. bakteeriyhteisöistä. Näissä olosuhteissa bakteerien lisääntymisnopeus kuntoasteen indikaattorina menettää osittain merkityksensä, koska kunto riippuu nyt vuorovaikutuksen tehokkuudesta muiden yhteisöjen kanssa.
Todettiin, että sopeutumisen alku- ja loppuvaiheessa mutaatioiden intensiivisin kiinnittyminen tapahtui eri geeneissä. Tämä ilmiö johtuu kolmesta tekijästä:
Siten kokeilu tuhosi aiemmat ajatukset aseksuaalisen populaation sopeutumisesta vakaisiin ympäristöolosuhteisiin. Toisin kuin odotettiin, mukautuva evoluutio ei käytännössä hidastu, ja saavutettaessa väestön tietty sopeutumisaste ympäristöön syntyy populaation rakenteen spontaani komplikaatio.