Dot blotting

Dot blot  on tekniikka, jota käytetään molekyylibiologiassa erilaisten makromolekyylien, kuten nukleiinihappojen tai proteiinien, havaitsemiseen. Tämä tekniikka on yksinkertaistus Western blotista : tutkittuja makromolekyylejä sisältävät näytteet levitetään välittömästi nitroselluloosa- tai PVDF-kalvolle ohittaen PAAG:n alustavan elektroforeesin vaiheen (erityisesti proteiinien kanssa työskennellessä).

Protokolla työskentelyyn PVDF-kalvon kanssa

  1. Levitä testinäytteet kuivalle PVDF-kalvolle (1-3 µl liuosta pistettä kohti). PVDF-kalvon kanssa työskennellessä puskurilla, johon näytteet liuotetaan, tulee olla riittävän korkea ionivahvuus , muuten liuos ei yksinkertaisesti pääse kalvoon sen hydrofobisten ominaisuuksien vuoksi.
  2. Kalvo on kuivattava. Yleensä 30 minuuttia huoneenlämmössä riittää.
  3. Aseta kalvo puskuriin epäspesifisten vasta-aineiden sitoutumisen vähentämiseksi. Epäspesifisiä vuorovaikutuksia vähentävän aineen roolia hoitaa yleensä naudan seerumialbumiini (BSA) tai maitojauhe . 20 minuuttia - 1 tunti huoneenlämmössä.
  4. Aseta kalvo primaariseen vasta-ainepuskuriin. Tässä puskurissa on myös BSA:ta tai maitojauhetta, mutta pienempi määrä. 1 tunti - PÄÄLLÄ, T = 4 С°.
  5. Pese kalvo 3 x 5 min.
  6. Aseta kalvo puskuriin, joka sisältää sekundääristä vasta-ainetta, joka sisältää havaitsemisainetta, kuten piparjuuriperoksidaasia . 1-2 tuntia huoneenlämmössä.
  7. Pese kalvo uudelleen 3 x 5 min.
  8. Aseta kalvo detektioliuokseen. On parempi lisätä 30 % vetyperoksidia kaupalliseen liuokseen (noin 10-50 µl per 10 ml liuosta). 1-3 minuuttia huoneenlämmössä.
  9. Havaitseminen. Käytettäessä sekundaarisia vasta-aineita piparjuuriperoksidaasin kanssa havaitaan kemiluminesenssisäteilyä, joka aiheutuu leikkaamalla substraatti detektioliuoksesta piparjuuriperoksidaasilla. Jos käytetään kemiluminesenssia rekisteröivää laitetta, hyvin pieni valotus (enintään 2 minuuttia) riittää

Katso myös