Western blot (western blot, proteiini-immunoblot, eng. Western blot ) on analyyttinen menetelmä, jota käytetään määrittämään spesifisiä proteiineja näytteestä . Ensimmäisessä vaiheessa käytetään proteiinielektroforeesia polyakryyliamidigeelissä denaturoituneiden polypeptidien erottamiseksi pituuden (yleensä SDS :n läsnä ollessa ) tai proteiinin kolmiulotteisen rakenteen perusteella (natiivitilassa). Seuraavaksi proteiinit siirretään nitroselluloosa- tai PVDF - kalvolle, minkä jälkeen ne havaitaan käyttämällä tietylle proteiinille spesifisiä vasta -aineita [1] [2] .
On monia kaupallisia yrityksiä, jotka ovat erikoistuneet vasta-aineiden (sekä monoklonaalisten että polyklonaalisten ) tuotantoon kymmeniä tuhansia erilaisia proteiineja vastaan [3] .
Western blot -menetelmää käytetään molekyylibiologiassa , biokemiassa , genetiikassa ja muilla luonnontieteen aloilla.
Muissa vastaavissa menetelmissä käytetään vasta-aineita proteiinien havaitsemiseen kudoksissa ja soluissa immunovärjäyksen ja entsyymi-immunosorbenttimäärityksen ( ELISA ) avulla .
Western blotting kehitettiin George Starkin laboratoriossa Stanfordissa . Nimen Western Blot antoi tekniikalle W. Neal Burnette [4] ja se on sanaleikki nimestä Southern Blot , joka on Edwin Southernin aiemmin kehittämä DNA - tunnistustekniikka . Samanlaista menetelmää RNA :n määrittämiseksi kutsutaan Northern blottingiksi , ja translaation jälkeisten proteiinimuunnosten havaitsemista kutsutaan Eastern blottingiksi .
Näyte voidaan ottaa koko kudoksesta tai soluviljelmästä. Useimmissa tapauksissa kovat kudokset jauhetaan ensin sekoittimella (suurille näytteille), homogenisaattorilla (pienemmät tilavuudet) tai sonikaatiolla . Samalla bakteerit, virukset ja muut ympäristökomponentit ovat myös proteiinin lähde.
Erilaisia pesuaineita , suoloja ja puskureita voidaan käyttää parantamaan solujen hajoamista ja proteiinien liukenemista . Proteaasin ja fosfataasin estäjiä lisätään usein estämään näytteiden pilkkominen omien entsyymiensä vaikutuksesta . Kudosten valmistelu suoritetaan usein matalissa lämpötiloissa proteiinien denaturoitumisen välttämiseksi .
Biokemiallisten ja mekaanisten fraktiointitekniikoiden yhdistelmiä, mukaan lukien erityyppiset suodatus ja sentrifugointi , käytetään erilaisten soluosastojen ja organellien erottamiseen .
Proteiinit erotetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Proteiinien erottaminen voidaan tehdä isoelektrisen pisteen (pI), molekyylipainon , sähkövarauksen tai näiden parametrien yhdistelmän avulla.
Yleisin menetelmä proteiinien erottamiseksi on elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä natriumdodekyylisulfaatin ( SDS ) läsnä ollessa Laemmlin mukaan . [5] SDS aiheuttaa proteiinien denaturoitumista ja säilyttää ne denaturoituneessa tilassa; disulfidisidosta vähentäviä aineita, kuten ditiotreitolia ja merkaptoetanolia , käytetään tuhoamaan proteiinien sekundäärisiä ja tertiäärisiä rakenteita . Denaturoidut polypeptidit kulkeutuvat sähkökentässä akryyliamidigeelin läpi anodille , jolloin pienemmät proteiinit liikkuvat nopeammin ja erottuvat siten molekyylipainon mukaan. Akryyliamidin pitoisuus määrää geelin erottelukyvyn - mitä korkeampi akryyliamidin pitoisuus, sitä parempi pienimolekyylipainoisten proteiinien erotuskyky. Pieni akryyliamidipitoisuus parantaa korkean molekyylipainon proteiinien resoluutiota. On myös mahdollista käyttää kaksiulotteista elektroforeesia (2-D) . Tässä tapauksessa proteiinien erotus suoritetaan kahteen suuntaan - niiden isoelektrisen pisteen mukaisesti ensimmäisessä suunnassa ja molekyylipainon mukaisesti - toisessa.
Geelillä olevat näytteet asetetaan taskuihin. Pääsääntöisesti yksi "raiteista" jätetään molekyylipainomarkkereille (proteiiniseoksille, joiden massat tunnetaan). Jännitteen kytkemisen jälkeen proteiinit liikkuvat sähkökentässä eri nopeuksilla. Erot etenemisnopeudessa - elektroforeettinen liikkuvuus - johtavat proteiinien erottumiseen vyöhykkeiksi ( englanniksi bands ).
Jotta proteiinit saataisiin saataville vasta-aineita ja lisädetektiota varten, ne siirretään yhdessä geeliliuskan kanssa nitroselluloosasta tai polyvinylideenifluoridista ( PVDF ) valmistetulle kalvolle . Kalvo asetetaan geelin päälle ja pino suodatinpaperia asetetaan sen päälle. Koko pino asetetaan siirtopuskuriin, joka kapillaaritoiminnan vaikutuksesta siirtää paperia ylöspäin kuljettaen proteiinit mukanaan. Toinen menetelmä proteiinien siirtämiseksi on nimeltään elektroblottaus , ja se käyttää sähkövirtaa proteiinien siirtämiseen geelistä kalvolle. Proteiinit siirtyvät geelistä kalvolle säilyttäen samalla sijaintinsa. Tämän "blottaus" ( englanniksi blotting ) -prosessin seurauksena proteiinit jäävät detektiokalvon ohuelle pintakerrokselle. Molempia kalvovariantteja käytetään niiden epäspesifisten proteiinia sitovien ominaisuuksien vuoksi. Proteiinisitoutuminen perustuu sekä hydrofobisiin vuorovaikutuksiin että sähköstaattisiin vuorovaikutuksiin kalvon ja proteiinin välillä. Nitroselluloosakalvo on halvempaa kuin PVDF, mutta se on paljon hauraampaa ja vähemmän kestävää uudelleenmerkintöjä.
Proteiinien siirtymisen tasaisuus ja kokonaistehokkuus geelistä kalvolle voidaan tarkistaa värjäämällä kalvo Coomassie blue - tai Ponceau S -väreillä . Coomassie on yleisin näistä kahdesta, kun taas Ponceau S on herkempi ja vesiliukoisempi, mikä helpottaa kalvon myöhempää puhdistamista ja merkitsemistä. [6]
Kun kalvo on valittu sen kykyä sitoa proteiineja, vasta-aineet ja kohdeproteiini on valittu, on vältettävä vuorovaikutusta kalvon ja kohdeproteiinin havaitsemiseen käytetyn vasta-aineen välillä (koska vasta-aine itse on proteiini). Epäspesifinen sitoutuminen estetään asettamalla kalvo laimeaan proteiiniliuokseen - tavallisesti naudan seerumin albumiiniin tai rasvattomaan kuivamaitoon (molemmat edullisia), jossa on pieni prosenttiosuus pesuainetta, kuten Tween 20 tai Triton X-100 . Laimean liuoksen proteiini kiinnittyy kalvoon kaikissa paikoissa, joissa kohdeproteiini ei ole kiinnittynyt. Siksi vasta-aineita lisättäessä ainoa vapaa paikka kalvolla, johon ne voivat kiinnittyä, ovat spesifisten kohdeproteiinien sitoutumiskohdat. Tämä tausta "kohina" lopullisessa Western blot -tutkimuksessa johtaa puhtaisiin tuloksiin ja väärien positiivisten tulosten eliminoimiseen.
Havaitsemisprosessin aikana kalvo "leimataan" mielenkiinnon kohteena olevalla proteiinilla modifioidulla vasta-aineella, joka on sitoutunut reportterientsyymiin, jota ylläpidetään sopivalla alustalla, mikä johtaa kolorimetriseen reaktioon ja antaa värin. Eri syistä tunnistus suoritetaan kahdessa vaiheessa, vaikka yksivaiheinen tunnistusmenetelmä on nyt saatavilla tietyille sovelluksille.
Vasta-aineita tuotetaan altistamalla isäntäluokka tai immuunisoluviljelmä jollekin proteiinille (tai sen osalle). Tämä on yleensä osa immuunivastetta, mutta tässä (määrityksessä) kerättyjä vasta-aineita käytetään spesifisenä ja herkänä havaitsemistyökaluna, joka sitoutuu suoraan proteiiniin.
Salpauksen jälkeen laimennettua primaarista vasta-aineliuosta (yleensä 0,5-5 µg/ml) inkuboidaan kalvon kanssa ja sitä ravistetaan varovasti. Yleensä liuos koostuu puskuroidusta suolaliuoksesta, jossa on pieni prosenttiosuus pesuainetta, joskus maitojauhetta tai BSA:ta. Vasta-aineliuos ja kalvo voidaan sulkea yhteen ja inkuboida missä tahansa 30 minuutista yön yli. Niitä voidaan myös inkuboida eri lämpötiloissa; korotetuissa lämpötiloissa havaitaan parempi sitoutuminen - sekä spesifinen (kohdeproteiinille, "signaali1") että epäspesifinen ("kohina").
Kun kalvo on huuhdeltu sitoutumattomien primääristen vasta-aineiden poistamiseksi, kalvo altistetaan muille vasta-aineille, jotka sitoutuvat suoraan primääristen vasta-aineiden luokkaspesifisiin alueisiin. Nämä tunnetaan sekundaarisina vasta-aineina, ja niiden kohdeominaisuuksien mukaan niitä kutsutaan yleisesti "anti-hiiriksi", "anti-vuohiksi" ja niin edelleen. Vasta-aineet saadaan eläinlähteestä (tai hybridoomaviljelmän eläinlähteistä ); hiiren vastaiset sekundaariset vasta-aineet sitoutuvat useimpiin hiirestä peräisin oleviin primaarisiin vasta-aineisiin. Tämä luo säästöjä sallimalla yksittäisen laboratorion käyttää yhtä vasta-aineiden massatuotannon lähdettä ja johtaa paljon paremmin toistettavissa oleviin tuloksiin. Toissijaiset vasta-aineet ovat yleensä sitoutuneet biotiiniin tai reportterientsyymiin , kuten alkaliseen fosfataasiin tai piparjuuriperoksidaasiin . Tämä tarkoittaa, että useat sekundaariset vasta-aineet voivat sitoutua yhteen primääriseen vasta-aineeseen ja vahvistaa signaalia.
Kemiluminoivan aineen leikkaamiseen käytetään yleisimpiä piparjuuriperoksidaasiin liittyviä sekundaarisia vasta-aineita, ja reaktiotuote tuottaa luminoivaa säteilyä suhteessa proteiinin määrään. Arkki valoherkkää valokuvakalvoa asetetaan kalvoa vasten ja altistetaan reaktiosäteilylle, jolloin saadaan kuva blotissa olevista vasta-ainejuovista. Halvempi mutta vähemmän herkkä lähestymistapa, jossa käytetään 4-kloorinaftoliväriä sekoitettuna 1 % vetyperoksidiin ; peroksidiradikaalin reaktio 4-kloorinaftolin kanssa antaa tummanruskean värin, joka tallennetaan ilman erityistä valokuvafilmiä.
Kuten ELISPOT ja ELISA , entsyymi voidaan varustaa substraattimolekyylillä, jonka entsyymi muuntaa värilliseksi reaktiotuotteeksi, joka näkyy kalvolla (katso sininen raidallinen kuva alla).
Toinen sekundaarinen vasta-aineiden havaitsemismenetelmä käyttää vasta-aineita, joissa on sidottu fluorofori, joka emittoi lähiinfrapunassa (NIR). Fluoresoivan väriaineen säteilemä valo on vakio ja tekee fluoresenssin havaitsemisesta tarkemman ja herkemmän tavan mitata signaalin eroa, joka syntyy vasta-aineilla Western blotilla leimattujen proteiinien tuottamassa signaalissa. Proteiinit voidaan määrittää kvantitatiivisesti, koska signaali lasketaan erona (säteilynä) suhteessa kaikkiin kalvolla oleviin proteiineihin, mitattuna levossa, kemiluminesenssin (säteilyyn), joka mitataan dynaamisesti. [7]
Kolmas vaihtoehtoinen menetelmä käyttää radioaktiivista leimaa sekundääriseen vasta-aineeseen sitoutuneen entsyymin sijaan, kuten leimattua Staphylococcus Protein A -tyyppistä vasta-ainetta sitovaa proteiinia , jossa on radioaktiivinen jodin isotooppi. Muut menetelmät ovat turvallisempia, nopeampia ja halvempia, joten radioaktiivista havaitsemista käytetään harvoin.
Historiallisesti leimausprosessi on suoritettu kahdessa vaiheessa, koska primaarisia ja sekundaarisia vasta-aineita on suhteellisen helpompi tuottaa erillisissä prosesseissa. Tämä antaa tutkijoille ja yrityksille valtavan edun joustavuuden suhteen ja lisää vahvistusvaihetta havaitsemisprosessiin. Ottaen huomioon korkean suorituskyvyn proteiinimääritykset ja alhaiset havaitsemiskynnykset, on edelleen kiinnostusta kehittää yksivaiheinen leimausjärjestelmä, joka mahdollistaa prosessin suorittamisen nopeammin ja pienemmillä kustannuksilla. Se (yksivaiheinen järjestelmä) vaatii vasta-ainetunnisteita, jotka tunnistaisivat tutkittavan proteiinin ja kantaisivat samanaikaisesti markkerin havaitsemista varten - tunnisteita, jotka ovat tunnetuille "proteiinihännille" parhaiten saatavilla. Ensin leimoja inkuboidaan kaksivaiheisessa kalvossa, jossa on primaarisia vasta-aineita, ja sitten ne ovat valmiita suoraan havaitsemiseen useiden pesujen jälkeen.
Sitoutumattomien leimien poispesun jälkeen Western blot on valmis havaitsemaan kohdeproteiiniin sitoutuneita koettimia. Käytännössä kaikissa länsimaissa ei näy proteiineja, joissa on vain yksi nauha kalvolla. Likimääräinen koko lasketaan vertaamalla värjäytyneitä vyöhykkeitä elektroforeesilla lisättyihin molekyylipainomarkkereihin. Prosessi toistetaan rakenneproteiineilla, kuten aktiinilla tai tubuliinilla , jotka eivät muutu kokeiden välillä. Kohdeproteiinin määrä riippuu kontrollirakenneproteiinin määrästä ryhmien välillä. Tämä tekniikka korjaa kalvon kokonaisproteiinin määrää virheen tai epätäydellisen siirron sattuessa.
Kolorimetrinen tunnistusmenetelmä perustuu Western blot -tutkimuksen inkubaatioon substraatin kanssa, joka reagoi reportterientsyymin (kuten piparjuuriperoksidaasin ) kanssa "istuen" sekundaarisen vasta-aineen päällä . Liukoinen väriaine muuttuu eriväriseen liukenemattomaan muotoon, saostuen entsyymin viereen ja värjäämällä kalvon. Täplän kasvua rajoittaa liukoisen väriaineen pesu pois. Proteiinitaso arvioidaan densitometrisesti värjäyksen intensiteetin tai spektrofotometrin avulla .
Kemiluminesenssitunnistusmenetelmä perustuu nitroselluloosakalvon inkubaatioon substraatin kanssa, joka luminesoi vuorovaikutuksen jälkeen sekundaarisen vasta-ainereportterin kanssa . Valo tallennetaan valokuvausfilmillä tai CCD -kameralla, joka tallentaa digitaalisesti Western blotin. Kuva analysoidaan densitometrisesti arvioimalla värjäytyneen proteiinin suhteellinen määrä ja antamalla kvantitatiivinen tulos optisen tiheyden yksiköissä. Uusi ohjelmisto mahdollistaa tietojen lisäanalyysin, kuten molekyylipainon määrityksen, jos sopivaa standardia on käytetty.
Radioaktiiviset leimat eivät vaadi entsyymisubstraatteja, mutta ne mahdollistavat lääketieteellisen radiografisen kalvon sijoittamisen Western blotin eteen, jolloin se (kalvo) voi olla vuorovaikutuksessa leimien kanssa ja luoda tummia alueita, jotka vastaavat tutkittavan proteiinin vyöhykkeitä. oikealla oleva kuva). Radioaktiivisten tunnistusmenetelmien kysyntä on laskussa niiden korkeiden kustannusten, korkeiden terveys- ja turvallisuusriskien sekä ECL:n tarjoamien vaihtoehtojen vuoksi.
Fluoresoivat etiketit virittyvät valolla ja lähettävät pidemmän aallonpituuden valoa, jonka havaitsevat valoanturit, kuten CCD - kamera, joka on varustettu asianmukaisilla emissiosuodattimilla. Kamera ottaa digitaalisen kuvan Western blot -analyysistä, mikä mahdollistaa hankittujen tietojen lisäanalyysin, kuten molekyylipainoanalyysin ja kvantitatiivisen Western blot -analyysin.