Avoin kromatiini ( englanniksi open chromatin ) - pienet kromatiinialueet , joissa ei ole nukleosomeja [1] . Nukleosomien istutuksen estävät yleensä kromatiiniin liittyvät proteiinitekijät , jotka tunnistavat tietyt DNA-sekvenssit . Näitä proteiineja ovat muun muassa transkriptiotekijät , DNA- tai RNA -polymeraasit . Avoin kromatiini osuu usein yhteen cis-säätelysekvenssien kanssa , nimittäin: promoottorit , tehostajat , eristimet , äänenvaimentimet, DNA-replikaation alkukohdat [2] . Kromatiinin avoimien osien koko on yleensä useita satoja emäspareja , keskimäärin noin 300 bp [3] .
Avoin kromatiini määritetään useimmiten DNaasi-herkkyysmenetelmällä. DNaasi I hyökkää ensisijaisesti kromatiinin nukleosomivapaisiin alueisiin, kun permeabilisoituja soluja tai eristettyjä tumia käsitellään sillä . Tässä suhteessa avointa kromatiinia kutsutaan usein DNaasi I -yliherkkiksi kohtiksi tai yliherkkiksi kohtiksi . Todennäköisyys DNA:n pilkkoutumiseen nukleaasin vaikutuksesta yliherkkien kohtien voi ylittää keskiarvon satoja ja jopa tuhansia kertoja. Yliherkkyys avoimelle kromatiini-DNaasi I:lle tulisi erottaa aktiivisesti transkriptoitujen geenien lisääntyneestä yleisestä DNaasiherkkyydestä [4] .
Riippuen niiden proteiinitekijöiden tyypistä, joiden sitoutuminen DNA:han estää nukleosomien laskeutumisen, DNaasi I:n yliherkät kromatiinialueet voivat olla kudosspesifisiä tai konstitutiivisia, toisin sanoen niitä voi olla soluissa, jotka ovat erilaistuneet eri reittejä pitkin.
Avoimen kromatiinin alueiden kartoittamiseen käytetään DNaasi - herkkyyttä ( DNaasi I -yliherkkyyttä ) ja säätelyelementtien eristämistä formaldehydillä . sääntelyelementtien formaldehydiavusteinen eristys (FAIRE) [1] . DNaasi-herkkyysmenetelmällä ei voida määrittää, mikä säätelykohta tämä avoimen kromatiinin alue on [1] .
Aikaisemmin DNaasi-herkkyysmenetelmän tulosten analyysi suoritettiin Southern blot -hybridisaatiolla ( eng. Southern blot ). Tämä ei antanut meille mahdollisuutta analysoida suurta määrää sivustoja sekä löytää uusia yliherkkyyskohtia. DNaasi-herkkyysanalyysi voidaan suorittaa myös käyttämällä reaaliaikaista PCR:ää (kvantitatiivinen PCR). Tämä on paljon yksinkertaisempaa kuin Southern blot -hybridisaatio, mutta tällä menetelmällä on myös rajoitettu määrä analyysikohtia, eikä sitä voida käyttää genominlaajuiseen tutkimukseen DNaasi I -herkkyyskohtien jakautumisesta [5] .
Korkean suorituskyvyn sekvensointi- ja DNA - mikrosirumenetelmien kehittäminen mahdollistaa avoimien kromatiinialueiden kartoituksen koko genomissa [ 6 ] . Lisäksi DNaasi-herkkyysmenetelmän yhdistelmä kromatiini - immunosaostusmenetelmän ( ChIP) kanssa , jota seuraa korkean suorituskyvyn sekvensointi , antaa lisätietoja spesifisten transkriptiotekijöiden sitoutumisesta aktiivisiin kromatiinikohtiin [1] .
Toinen tapa kartoittaa avoimen kromatiinin alueita on suorittaa kromatiini-immunosaostus ( ChIP ) histonien vasta-aineille . Samaan aikaan avoimien kromatiinialueiden tulisi olla huonosti edustettuina, koska nukleosomit eivät liity niihin. DNaasi-herkkyys- ja histoni-immunosaostusmenetelmä antavat samanlaisia tuloksia [7] .
Eukaryoottigenomeissa ei- koodaavat sekvenssit, jotka osallistuvat geeniekspression säätelyyn organismin eri kehitysvaiheissa tai eri kudoksissa, ovat erityisen tärkeitä . Säätelyalueiden löytämisestä ja karakterisoinnista tulee olennainen geenien ilmentymismallien ymmärtäminen [5] . Joten ihmisen genomissa yli 95 % DNA:sta on ei-koodaavaa . Tämä sekvenssiluokka sisältää roska-DNA :n lisäksi tärkeitä säätelysekvenssejä: promoottorit, tehostajat, äänenvaimentimet, eristimet tai kontrollilokukset ( locus control regions (LCR) ) . ENCODE-konsortio on osoittanut, että 1 % :ssa ihmisen genomista tunnistetut DNaasi I -yliherkkyyskohdat ovat histonimuutosten , varhaisten replikaatiokohtien , transkription aloituskohtien ja transkriptiotekijän sitoutumiskohtien markkereita [8] . Myös avoin kromatiini liittyy usein aktiivisesti transkriptoituihin ei-koodaaviin RNA:ihin [8] .
Ei-koodaavien säätelysekvenssien lisäksi avoin kromatiini liittyy myös aktiivisesti transkriptoitujen geenien eksoniin ja introniin . Erityisen usein tällaiset avoimen kromatiinin alueet osuvat yhteen geenin ensimmäisen eksonin ja intronin kanssa [5] . Avoimen kromatiinin läsnäolo ei kuitenkaan ole riittävä edellytys geenin aktiivisuudelle. Avoimeen kromatiiniin liittyvät transkriptioimattomat geenit ovat "valmiustilassa" transkriptioon ( englanniksi poised state ) [5] . Siten avoimen kromatiinin muodostuminen tai siirtyminen inaktiiviseen tilaan on tärkeää geeniekspression säätelylle.
Ei vain transkriptiotekijöiden ja muiden säätelyproteiinien sitoutumiskohdat voi olla vapaita nukleosomeista. Jotkut DNA-sekvenssit eivät pysty kietoutumaan nukleosomaalisten pallosten ympärille. Nämä ovat sekvenssejä, joiden joustavuus on heikentynyt, ja sekvenssejä, joilla on taipumus luoda ei-kanonisia rakenteita, kuten hiusneuloja [9] .
UCSC Genomic Browser -kuvakaappaus näyttää DNaseI - yliherkkyysklusterikohdan kolokalisoinnin geenin promoottorien kanssa. Avoimen kromatiinin alueita ympäröivät H3 [ -histonit, jotka on asetyloitu 27. lysiinitähteeseen ( H3K27Ac), joka on merkki aktiivisille kromatiinin säätelyalueille, kuten promoottoreille ja tehostajille. Lisäksi DNaasi-yliherkkyyskohdan alueella on sitoutumiskohta monille transkriptiotekijöille, joista löytyy konservoitunut transkription aloitustekijä TBP (se on TFIID :n pääosa ). Voit myös huomata RNA-polymeraasi II :n , joka suorittaa proteiinia koodaavien geenien transkription ihmisissä , usein sitoutuvan tällä alueella . Tälle DNaasi-yliherkkyyskohdalle on ominaista lisääntynyt konservatiivisuus nisäkkäiden keskuudessa ( Eng. Mammal Cons ), mikä tarkoittaa, että tämä sekvenssi säilyy evoluution aikana ja sen seurauksena sen toiminnallinen merkitys [8] .
Nukleosomeista vapaiden alueiden muodostuminen tapahtuu erityisten tekijöiden vaikutuksesta, jotka suorittavat nukleosomien kokoamisen, purkamisen ja liikkumisen. Nukleosomien sijainnin muuttamisprosessia kutsutaan kromatiinin uudelleenmuodostumiseksi . Se sisältää kromatiinin uudelleenmuotoilukompleksit - konservatiiviset proteiinikompleksit, jotka toimivat ATP :n energiankulutuksen kanssa . Kromatiinin uudelleenmuotoilu suoritetaan tiettyjen epigeneettisten merkkien käyttöönoton jälkeen - histonimodifikaatio tai DNA-metylaatio . Jos merkit vastaavat aktiivista kromatiinia (esimerkiksi histonin H3 asetyloitu 9. lysiini, histonin H3 di- ja trimetyloitu 4. lysiini ja monet muut), muodostuu avoimen kromatiinin alueita. Usein histonimuunnosten profiililla on selvä jakautuminen DNaasi I -yliherkkyyskohdan ympärille [5] .
Erittäin tehokkaat menetelmät mahdollistavat avoimien kromatiinialueiden jakautumisen vertailun saman organismin eri kudoksissa tai soluviljelmissä. Tällainen vertailu paljastaa merkittävän eron tällaisten alueiden jakautumisessa genomissa [5] . Tämä osoittaa tällaisten kohtien erilaisen aktiivisuuden eri kudoksissa. Siten geenin promoottori ja tehostaja voivat sijaita avoimella kromatiinialueella yhdessä kudoksessa ja olla nukleosomien sulkemassa toisessa. Tämä viittaa erilaiseen geeniekspressioon eri kudoksissa ja on tyypillisintä kudosspesifisille geeneille . Sitä vastoin geenejä , jotka löytyvät avoimelta kromatiinialueelta kaikissa kudoksissa ja solulinjoissa, kutsutaan yleensä taloudenhoitogeeneiksi . DNaasi-herkkyysprofiili voi myös muuttua solujen kehittymisen ja erilaistumisen aikana. Kudosspesifisten geenien aktiivisuuden tunnistamiseksi käytä geeniontologian määritelmää ( eng . Gene Ontology (GO) ) DNase-seq:n suorittamisen jälkeen [5] .