FAIRE-Seq ( Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements Sequencing ) on molekyylibiologinen menetelmä, jota käytetään määrittämään DNA:n säätelysekvenssejä (osia) [1] [2] . FAIRE-Seq on yhdistelmä kromatiinia säätelevien elementtien eristämisestä (FAIRE) ja korkean suorituskyvyn sekvensoinnista .
FAIRE on yksi menetelmistä avoimien kromatiinialueiden kartoittamiseen DNaasi I -yliherkkien ( DNase-seq ) ja kromatiini- immunosaostusmenetelmien ( ChIP-seq , ChIP-on-chip) ohella . Menetelmän ideaa ehdotettiin vuonna 2003 Saccharomyces cerevisiae -kromatiinin fraktioimiseksi kahteen osaan: ensimmäinen on RNA- polymeraasi II:n transkriptoima alue, toinen ei-koodaavia sekvenssejä ja alueita, jotka transkriptoivat RNA-polymeraasit I tai III . 3] . Erotus tapahtuu yksittäisten kromatiinialueiden eriasteisten formaldehydisilloitusten vuoksi. Vuonna 2007 ihmisen kromatiinin säätelyaktiivisuuteen liittyvät alueet tunnistettiin tällä menetelmällä; siten menetelmä läpäisi testin ja sai nimekseen FAIRE [4] . Alkuperäisessä versiossa data-analyysi perustui fluoresoivasti leimattujen DNA-fragmenttien hybridisaatioon DNA-mikrosirujen kanssa [4] , jota myöhemmin kutsuttiin FAIRE-siruksi. Myöhemmissä töissä ehdotettiin muita menetelmiä saatujen DNA-fragmenttien analysoimiseksi, joista yleisin on FAIRE-seq [1] .
Tähän mennessä menetelmästä on olemassa useita muunnelmia, jotka on tarkoitettu eläinten ja kasvien kudoksille. Kasvien kanssa työskenneltäessä vaaditaan tiukempia olosuhteita ja pitkää formaldehydin kiinnittymisaikaa johtuen soluseinämästä, lehtien vahamaisesta kynsinauhoksesta ja sienimäisen mesofyllin ilmatiloista [5] . Säätelyalueiden kartoituksen lisäksi menetelmä mahdollistaa aktiivisten elementtien vertailun eri kudoksissa (sekä kasvaimissa että terveissä). FAIRE-seqiä käyttävät kokeet kestävät keskimäärin noin kolme päivää, kun ei lasketa mukaan datan analysointia ja tulkintaa [6] .
Eukaryoottisoluissa avointa kromatiinia havaitaan aktiivisilla säätelyalueilla, joten nukleosomeja sisältämättömien alueiden eristäminen mahdollistaisi genomin säätelyelementtien kartoituksen solutyypistä riippumatta [2] . Kun formaldehydiä lisätään kudosviljelmään, muodostuu ristisidoksia proteiinien , proteiinien ja nukleiinihappojen, erityisesti DNA:n ja histonien, tai histonien välille. Seuraavaksi genominen DNA altistetaan ultraäänifragmentoinnille segmenteiksi, joiden pituus on keskimäärin 300-400 emäsparia. Myöhemmin fenoli-kloroformilla uuttamisen aikana proteiiniton DNA on vesifaasissa ja kovalenttisesti sitoutuneet DNA-proteiinikompleksit ovat faasin rajalla. Siten säätelyaktiivisuuteen liittyvät ja nukleosomeista vapaat (tai pienet määrät niitä sisältävät) genomin alueet sijaitsevat faasirajan yläpuolella vedessä. Ne voidaan uuttaa sieltä, puhdistaa vielä kerran jäljellä olevista proteiineista fenoli-kloroformilla, käsitellä ribonukleaasi A:lla ja saostaa uudelleen jatkoanalyysiä varten. Kontrollina käytetään DNA-näytettä, joka on saatu samasta kudosviljelmästä samoilla menetelmillä, mutta ilman formaldehydikiinnitystä [6] .
Lisäksi saatujen DNA-osien analyysimenetelmästä riippuen FAIRE-seq (DNA-fragmenttien korkean suorituskyvyn sekvensointi esim. Illuminalla ), FAIRE-siru (fluoresoivasti leimattujen DNA-fragmenttien hybridisaatio DNA-mikrosiruilla ), FAIRE-qPCR (DNA-osien kvantitatiivinen analyysi PCR:llä reaaliajassa ). Nyt FAIRE-seq on lähes kokonaan syrjäyttänyt muut menetelmät uutettujen DNA-fragmenttien määrittämiseksi [6] .
Sekvensointitietojen analysointi edellyttää sekvenssien kohdistamista referenssigenomiin, johon käytetään esimerkiksi Bowtietä . Sitten etsitään merkittäviä rikastusalueita . Näihin tarkoituksiin ZINBA:n käyttöä suositellaan. Toisin kuin FAIRE-siru ja FAIRE-qPCR, käytettäessä FAIRE-seq:iä riittävän syvällä genomin peitossa, kontrollinäyte saattaa puuttua [6] .
FAIRE-seq:n avulla voidaan etsiä kasvaintekijöiden kohdepromoottoreita , havaita ja testata potentiaalisia vapaan kromatiinin alueita, jotka eivät liity nukleosomeihin, tunnistaa genomin indusoituvia säätelyalueita ja kuvata genomin aktiivisia säätelyelementtejä. Menetelmän avulla voidaan myös arvioida säätelyalueiden nukleotidikoostumuksen vaihtelua eri populaatioissa [7] .
FAIRE-seq:n käyttö yhdessä muiden menetelmien, kuten DNase-seq:n, kanssa antaa luotettavamman ja laadukkaamman tuloksen [2] .
FAIRE-menetelmä ei vaadi solujen esikäsittelyä, koska formaldehydiä lisätään ravintoalustaan tai suoraan kudokseen, mikä johtaa nopeasti solukuolemaan, mikä mahdollistaa kromatiinin saamisen kiinnitystä edeltävässä tilassa. Samanaikaisesti erilaiset kiinnitysajat formaldehydillä vakiopitoisuudella antavat saman tuloksen. Toisin kuin ChIP [8] , menetelmä ei riipu vasta-aineiden luotettavuudesta ja vaihtelevuudesta. Lisäksi FAIRE ei vaadi entsyymien, kuten DNaasi tai MNaasi, käyttöä, joita käytetään yleisesti samanlaisissa menetelmissä nukleosomivapaiden alueiden havaitsemiseen. Entsymaattisen käsittelyn puuttuminen tekee tästä menetelmästä vähemmän vaihtelevan, luotettavamman ja toistettavamman [6] .
FAIRE on helposti mukautettavissa käytettäväksi kudosnäytteissä, koska FAIRE ei vaadi yksittäisen solun suspensiota tai tuman eristämistä. Tässä tapauksessa ainoa lisävaihe on pakastetun kudoksen jauhaminen karkeaksi jauheeksi ennen kiinnitystä [6] .
FAIRE voi havaita distaaliset säätelyelementit, jotka sijaitsevat kaukana promoottoreista (esim. transkription tehostajat), joita ei löydy DNaasi-seq :stä [2] .
Kokeellisen osan yksinkertaisuudesta huolimatta FAIRE-seq, kuten muutkin laajaan sekvensointiin liittyvät menetelmät, vaatii huomattavan määrän laskentaresursseja ja muistia tulosten tulkitsemiseen. Tässä suhteessa FAIRE-siru ja FAIRE-qPCR voivat olla houkuttelevampia [6] .
DNase-seq :iin ja ChIP-seq :iin verrattuna FAIRElla on pienempi signaali-kohinasuhde. Siksi FAIRE:n havaitsemat sivustot voivat poiketa vain vähän taustasignaalista ajoittain, mikä heikentää luottamusta tunnistettuihin sivustoihin. Tämä vaikutus pahenee, kun käytetään sekvensoimattomia havaitsemismenetelmiä. Huolimatta alhaisesta signaali-kohinasuhteesta, on syytä huomata, että FAIRE-tuloksilla on hyvä toistettavuus . Joidenkin aktiivisesti ekspressoituneiden geenien promoottoreiden havaitseminen on kuitenkin huonompi kuin muut menetelmät, kuten DNase-seq [2] .
Kudosfiksaation tehokkuus vaihtelee sen ominaisuuksien (puhtaus, läpäisevyys, solutiheys, rasvapitoisuus ja pinta-ala) mukaan, mikä voi vaikeuttaa eri kudoksilla saatujen tulosten vertailua [6] .
FAIRE-seq ihmisen genomitiedot ovat saatavilla osana ENCODE -projektia (Encyclopedia of DNA Elements) interaktiivisella UCSC Genome Browser -sivustolla joka tarjoaa pääsyn useiden selkärankaisten , selkärangattomien ja suurten malliorganismien genomitietoihin integroituna suureen kokoelmaan johdonmukaiset huomautukset [9] .