Kaksihybridianalyysi on molekyylibiologinen menetelmä, joka mahdollistaa proteiini-proteiini- ja DNA-proteiinivuorovaikutusten erittäin tarkan havaitsemisen in vivo -olosuhteissa .
Se perustuu transkriptiotekijöiden käyttöön, jotka koostuvat fysikaalisesti ja toiminnallisesti erotettavista domeeneista : DNA:ta sitovasta ( sitoutumisdomeeni, BD ) ja aktivaattoridomeenista ( aktivaatiodomeeni, AD ). Kahden rekombinanttiproteiinin fyysinen vuorovaikutus käynnistää niiden kanssa "silloittuneiden" transkriptiodomeenien fuusion, mikä aktivoi reportterigeenien ilmentymisen .
S. Fields ja O. Song kuvasivat ja käyttivät ensimmäistä kertaa kaksihybridianalyysimenetelmää vuonna 1989 [1] tutkiessaan GAL4 - transkriptiotekijää Saccharomyces cerevisiae -hiivassa . Siitä lähtien periaatetta proteiini-proteiini-vuorovaikutusten havaitsemisesta GAL4 - transkriptioaktivaattorin avulla on kuitenkin mukautettu luomaan muita vaihtoehtoisia menetelmiä, mukaan lukien jotkut, jotka pystyvät havaitsemaan DNA-proteiini- ja DNA-DNA-vuorovaikutuksia sekä moniproteiinikomplekseja.
Lisäksi hiivan lisäksi käytetään myös Escherichia colia [2] ja nisäkässoluja .
Kaksihybridianalyysimenetelmä perustuu galaktosidaasia koodaavien GAL -geenipromoottorien rakenteellisiin ominaisuuksiin . Näiden geenien promoottorit koostuvat TATA-laatikosta , UAS-aktivaattorisekvenssistä ja Inr- aloitusmotiivista . Galaktoosin ilmaantuminen soluun johtaa konformaatiomuutoksiin säätelyproteiineissa , minkä ansiosta Gal4p-proteiini voi alkaa toimia aktivaattorina eri GAL-promoottoreissa [3] .
Transkriptioaktivaattori GAL4p on endogeenisesti ilmentyvä 881 a.a. pitkä proteiini, joka sisältää 2 domeenia : DNA:ta sitovan (1-147 a.a.) ja aktivaattorin (771-881 a.a.). Luonnollisissa transkriptiotekijöissä nämä domeenit ovat osia yksittäisestä proteiinipallosta, mutta niitä voidaan myös syntetisoida erikseen säilyttäen alkuperäiset funktionsa.
Esimerkkinä kuvaamme klassisen kaksihybridisysteemimenetelmän laitetta, jota käytetään proteiinien välisten vuorovaikutusten havaitsemiseen. Proteiini A:n ja proteiini B:n välisen vuorovaikutuksen testaamiseksi luodaan yhdistelmämolekyylejä , joista toinen on proteiini A, joka on fuusioitu DNA:ta sitovaan domeeniin (A-CD), ja toinen on proteiini B, joka on fuusioitu aktivaattoridomeeniin ( HUONO). Kimeeristen proteiinien koostumuksessa domeenit säilyttävät tehtävänsä. Jokainen rekombinanttimolekyyli ei erikseen pysty aiheuttamaan transkription aktivoitumista , mutta koska se on lähellä, mahdollisesti proteiinien A ja B vuorovaikutuksesta johtuen, GAL4p-proteiinin alkuperäinen toiminta luodaan uudelleen ja reportterigeeni aktivoituu [4 ] [5] .
Hiivan kaksihybriiniseulonnassa käytetään usein geneettisesti muunnettuja hiivakantoja , joista puuttuu tiettyjen ravintoaineiden (tyypillisesti aminohappojen tai nukleiinihappojen ) biosynteesi . Tällaisia kantoja kutsutaan auksotrofisiksi . Kun kasvatetaan alustalla , josta puuttuu näitä ravinteita, hiiva kuolee. Seuraavaksi kaksi auksotrofista kantaa transfektoidaan plasmideilla , joissa galaktosidaasipromoottori säätelee puuttuvaa metabolisen reitin elementtiä koodaavan geenin transkriptiota . Yksi plasmidi sisältää myös proteiini A:n geenin fuusioituna SD:hen. Tässä tapauksessa proteiini A tunnetaan yleensä. Toinen plasmidi sisältää AD-fuusio-B-proteiinigeenin. Tässä tapauksessa proteiini B voi olla joko proteiini, jonka funktio on tuntematon, mahdollisuus sitoutua proteiini A:han on tarkistettava, tai yhden B-AD- fuusioproteiinigeenin sisältävän plasmidin sijasta voi olla kokonainen kirjasto erilaisia plasmidit, jotka sisältävät geenejä eri proteiineille fuusioituna AD:n kanssa. Siten proteiinikirjastosta seulotaan vuorovaikutuksen mahdollisuus proteiini A:n kanssa. Kirjastoa käyttävissä menetelmissä oletetaan, että vain yksi plasmidipari saapuu tutkittavaan soluun, joten jokainen solu ei tuota enempää kuin yhtä proteiinia kirjastosta. Sitten kaksi auksotrofista kantaa risteytetään [2] . Tuloksena olevassa hybridissä A:n ja B:n välisen onnistuneen vuorovaikutuksen yhteydessä AD- ja SD-domeenit kytkeytyvät epäsuorasti, ja AD on lähellä reportterigeenin transkription aloituskohtaa. Tuloksena oleva kanta ei ole auksotrofinen. Vuorovaikutuksen puuttuessa ei ole transkriptiota, hybridi on auksotrofeeni. Siksi onnistunut vuorovaikutus liittyy solun fenotyypin muutokseen .
Kaksihybridianalyysi ei vaadi erityisiä kalliita laitteita ja mahdollistaa kokonaisten kirjastojen analysoinnin. Tämän menetelmän merkittävä haittapuoli on kuitenkin suuri määrä vääriä positiivisia tuloksia .
Tämä menetelmä perustuu samoihin periaatteisiin kuin kaksihybridijärjestelmä, sillä erolla, että proteiinit A ja B eivät ole suoraan vuorovaikutuksessa toistensa kanssa. Niiden välissä on kolmas alkuaine - aine X. Tämä aine voi olla DNA- tai RNA -molekyyli , pieni orgaaninen ligandi , inhibiittori , joka sitoutuu kovalenttisesti entsyymin aktiiviseen keskustaan . Menetelmän avulla voidaan tunnistaa NK - proteiinivuorovaikutukset, entsymaattinen aktiivisuus suhteessa tiettyyn substraattiin , proteiinin vuorovaikutus pienten molekyylien kanssa [4] .
Suurin ero "suoraan" kaksihybridijärjestelmään tässä on, että geeni, jonka ilmentymistä tämä järjestelmä säätelee, on tappava. Siten, jos proteiinien A ja B välillä on vuorovaikutusta, hybridiorganismi kuolee. Tätä menetelmää käytetään määrittämään aminohappotähteet, jotka ovat välttämättömiä globulien A ja B välisessä vuorovaikutuksessa [4] .
Tässä klassisen menetelmän muunnelmassa on vain yksi rekombinanttimolekyyli, AD-A-B-SD. Tässä tapauksessa tunnettu DNA -sekvenssi insertoidaan ennen reportterigeeniä , BD vaihtelee. Tällä tavalla on mahdollista määrittää, mitkä proteiinit sitoutuvat tiettyyn DNA-sekvenssiin [4] .
Oletetaan, että mitä tahansa elävää solua voidaan käyttää kaksihybridijärjestelmän toteuttamiseen, mutta on olemassa käytännön näkökohtia valitun solulinjan alhaisesta hinnasta ja stabiilisuudesta [6] .
Historiallisesti ensimmäinen organismi kaksihybridijärjestelmässä on hiiva . Hiiva on vakaa, yksinkertainen ja hyvin tutkittu malliorganismi . Hiivasolut säilyttävät neutraalit pH -arvot solun sisällä huolimatta happamista pH -arvoista ulkoisessa ympäristössä. Hiivat ovat myös heikosti herkkiä solunulkoisille myrkkyille, niitä voidaan käsitellä ilman molekyylimenetelmiä [7] .On tärkeää huomioida tuman lokalisaatiosignaalien tarve , koska hiivan koko geneettinen laite on paikantunut ytimeen. Niiden puuttuessa mahdollisesti vuorovaikutuksessa oleva proteiinipari ei transloidu eikä ole vuorovaikutuksessa.
Bakteerijärjestelmiä voidaan käyttää samalla tavalla kuin hiivajärjestelmiä. Niissä on selvästi enemmän potentiaalia ja ne ovat parempia käytettäessä kaksihybridijärjestelmää. Bakteerijärjestelmät mahdollistavat sellaisten kirjastojen käytön ja analysoinnin, jotka ovat suurempia kuin 108 , niillä on nopeampi kasvunopeus ja suurempi potentiaali pienten molekyylien läpäisevyyteen. Tuman lokalisointisignaaleja ei myöskään tarvita , ja on mahdollista tutkia hiivalle myrkyllisiä proteiineja. Nopeampien selektiivisten menetelmien ansiosta varmistetaan alhainen väärien positiivisten prosenttiosuus (3·10 −8 ) [6] .
Proteiinien vuorovaikutusta tutkiessa on mahdollista tunnistaa uusia toimintoja. Käyttämällä yhtä tunnettua A0 - proteiinia , tuntemattomien Bn-proteiinien kirjastoa ja sitä seuraavaa vertailua aiemmin tunnettuun A0B0- vuorovaikutteisten proteiinien pariin , voidaan saada tietoa Bn: n ja Bo : n samankaltaisuudesta . Samanlaisia tietoja voidaan saada tutkimalla tunnetun proteiinikirjaston vuorovaikutuksia yhden proteiinin kanssa, jolla on tuntematon toiminta [7] .
Kaksihybridijärjestelmää käytetään, kun tunnetun ja vuorovaikutuksessa olevan proteiinin parille on tarpeen määrittää aminohappotähteet, jotka muodostavat niiden vuorovaikutusalueen. Tätä varten käytetyissä plasmideissa suoritetaan mutaatioita DNA-emäspareissa, jotka vastaavat spesifisiä aminohappoja . Siten muodostuu aminohappotähteiden pistemuutoksia sisältävä kirjasto, jonka perusteella kaksihybridijärjestelmää käyttämällä voidaan määrittää tietyn aminohapon merkitys vuorovaikutuksen muodostumisessa kumppaniproteiinin kanssa [7 ] .
Nykyaikaiset menetelmät mahdollistavat tutkimukseen valitun solun rakentamisen siten, että se heijastaa yhtä tai toista tutkimukseen valittua molekyylinäkökohtaa. Tällaisissa soluissa on mahdollista testata kaksihybridijärjestelmän välittämän lääkkeen annostelun spesifisyyttä ja tarkkuutta, jolloin voit nopeasti ratkaista esiin tulevien sivuvaikutusten ongelmat.
Samanlaista lähestymistapaa käytetään myrkkyihin ja myrkkyihin [7] .
Sinkkisormiproteiinien (sinkkisormiproteiinit tai ZFP:t) etsimiseen on käytetty menestyksekkäästi kaksihybridianalyysiin perustuvia menetelmiä [2] . DNA:ta sitovana proteiinina ZFP :tä käytetään luomaan epästandardeja DNA:ta sitovia domeeneja, jotka koordinoituvat DNA-sekvenssin ennalta määrätyn alueen kanssa.
Menetelmä perustuu ZFP -kirjaston luomiseen muuttamalla satunnaisesti tiettyjä aminohappotähteitä. Edelleen niistä valitaan ne, jotka pystyvät olemaan vuorovaikutuksessa UAS:n sisältämän kohdepaikan kanssa, vaadittujen ominaisuuksien mukaan. Jokainen ZFP tunnistaa kuitenkin vain pienen DNA-osan, noin 3-4 emästä, joten kompleksia, joka koostuu kahdesta ZFP :stä , joilla on vakiosekvenssi, käytetään parantamaan sitoutumistarkkuutta ja estämään UAS:n ulkopuolisten kohtien tunnistaminen . Tällaisen kompleksin ZFP :t sitoutuvat kohdealueen reunoihin ja estävät sitoutumisen UAS:n ulkopuolella [2] .
Useita muita DNA:ta sitovia domeeneja voidaan myös tutkia käyttämällä tätä järjestelmää.