Yhden molekyylin reaaliaikainen sekvensointi eli SMRT on uuden sukupolven DNA-sekvensointimenetelmä, jonka on kehittänyt Pacific Biosciences .
Menetelmän ideana on määrittää DNA-sekvenssi seuraamalla yhden DNA-polymeraasimolekyylin toimintaa reaaliajassa. Samanaikaisesti DNA-polymeraasi täydentää tutkittavan DNA - molekyylin toisen juosteen käyttämällä nukleotideja , jotka on leimattu erilaisilla fluoresoivilla leimoilla ; rekisteröimällä leimatieto on mahdollista ymmärtää, mitä nukleotidia DNA-polymeraasi parhaillaan lisää.
Tämäntyyppisten sekvensserien järjestely mahdollistaa yhden molekyylin tasolla yhden yksijuosteisen DNA-molekyylin komplementaarisen juosteen synteesin havainnoinnin yhden DNA-polymeraasimolekyylin avulla. Tässä tekniikassa fluoresoivasti leimatut nukleotidit ja korkearesoluutioinen konfokaalinen mikroskopia mahdollistavat monien polymeraasien reaaliaikaisen ja samanaikaisen sekvenssin sekvensoinnin [1] .
ZMWMenetelmä perustuu Zero-mode waveguide (ZMW) käyttöön - halkaisijaltaan useita kymmeniä nanometrejä painavia syvennyksiä , joiden pohjaan kiinnittyy yksittäinen DNA-polymeraasimolekyyli. Valo syötetään pohjan kautta ZMW-kennoon. ZMW-kennon suunnitteluominaisuus ei salli valoaallon leviämistä ja jättää vain noin 20 zeptolitraa (20 × 10 -21 litraa) kennon pohjalle valaistuksi. Tämä tekee mahdolliseksi tarkkailla yksittäisen fluoresoivan leiman fluoresenssia, joka on kiinnittynyt DNA-polymeraasin tällä hetkellä insertoimaan nukleotidiin. Tämän mukaisesti neljään nukleotidityyppiin on ommeltu erilaisia fluoresoivia leimoja, mikä mahdollistaa niiden erottamisen. Tämän seurauksena DNA-ketjun polymeroinnin aikana ZMW:hen kiinnitetyllä entsyymillä on mahdollista saada fluoresenssin intensiteetin riippuvuus ajasta, jonka kaaviosta DNA-sekvenssi määritetään eri spektrin huipuista [ 1] .
Sekvensoinnissa käytetään ns. SMRT-soluja , jotka sisältävät noin 150 000 ZMW -kennoa, jotka ovat syvennyksiä alumiinikalvossa , joka on kerrostettu piisubstraatille [2] .
NukleotiditTämä menetelmä käyttää leimoja ( fluoroforeja ), jotka on kiinnitetty nukleotidin terminaaliseen fosfaattiryhmään . Tällaisella leimalla on vähemmän vaikutusta DNA-polymeraasin toimintaan, mikä on erittäin tärkeää reaaliaikaisessa sekvensoinnissa. Kun nukleotidi lisätään kasvavaan DNA-juosteeseen, DNA-polymeraasi lohkaisee leiman pyrofosfaatin mukana . Tämän seurauksena fluorofori voi diffundoitua ulos havaitusta tilavuudesta eikä enää vaikuta tallennettuun signaaliin, ja nukleotidi integroituu DNA-ketjuun ilman "makeweights". Näin ollen mittaamalla yhden värin pitkäaikainen (millisekunnin) hehku, kun leimattu nukleotidi on kiinnittynyt polymeraasiin nopeasti diffundoituvan (mikrosekuntia) neljän taustaa vasten, on mahdollista määrittää DNA-templaattiketjun sekvenssi [1] .
Yksimolekyylinen reaaliaikainen sekvensointimenetelmä mahdollistaa erittäin pitkien lukujen (DNA-sekvenssien) saamisen (keskimäärin noin 20 000 nukleotidia, jopa 60 000 nukleotidia), mikä helpottaa datan jatkoanalyysiä ja välttää useita työskentelyssä syntyviä ongelmia. lyhyillä lukemilla. Se toimii ilman , että tutkittavana oleva DNA on ensin monistettu PCR :n avulla . Tämä menetelmä tarjoaa suuren sekvensointinopeuden (teoriassa sitä rajoittaa vain DNA-polymeraasin nopeus) [1] . Menetelmälle on tunnusomaista korkea herkkyys ja spesifisyys: mahdollisuus havaita vähäisiä muunnelmia sekanäytteistä, joiden esiintymistiheys on alle 0,1 %. Se mahdollistaa myös korkean tarkkuuden sekvensoinnin. Tällä hetkellä se ei ole kovin korkea (83 %), mutta tarkkuutta voidaan parantaa toistuvalla DNA-molekyylin sekvensoinnilla (> 99 % 15 toistolla) [3] [4] .
Menetelmän haittoja ovat laitteen korkea hinta - 600 000 dollaria [5] . Sille on ominaista suhteellisen korkea virhetaso, joka johtuu fluoroforien emissiospektrien leikkauspisteestä. Lisäksi polymeraasien satunnainen kiinnittyminen ZMW-solun pohjaan johtaa entsyymien lukumäärän Poisson-jakaumaan solua kohden [1] .
Yksimolekyylisten reaaliaikaisten sekvensointilukujen pituus on verrattavissa tai suurempi kuin Sangerin menetelmässä , mikä mahdollistaa de novo -genomien sekvensoinnin ja yksinkertaistaa niiden kokoamista [1] . Pitkät lukemat tarjoavat kontekstin, jota tarvitaan genomin toistoasemien oikeaan paikantamiseen. Mahdollisuus saada pitkiä DNA-osuuksia sekvensoinnin aikana on tärkeä myös metagenomiikalle : on mahdollista tunnistaa organismeja sekapopulaatioissa - esimerkiksi mikrobiomissa . Koska genomin kokoamiseen tarvitaan vähemmän lukuja samoista alueista, genomin purkaminen tällä menetelmällä vaatii vähemmän vaivaa. Yhden molekyylin reaaliaikainen sekvensointi on osoitettu de novo genomin sekvensoinnilla tutkimuksissa, joissa analysoitiin vuoden 2011 Saksan suolistoinfektioepidemiaa ja vuoden 2010 koleraepidemiaa Haitissa [6] [7] .
"Kolmannen sukupolven" sekvensointitekniikka yhdistettynä vanhempiin menetelmiin voi lisätä genomin kokoamisen tarkkuutta. Toisen sukupolven sekvensserit pystyvät lukemaan genomin pieninä 100-700 emäsparin fragmentteina, mutta tällaisia lukuja on vaikea koota oikeaan järjestykseen. "Kolmannen sukupolven" instrumentit (erityisesti Pacific Biosciencesin PacBio RS) voivat tuottaa jopa 23 kb:n lukemia, mutta tekevät enemmän virheitä kuin normaali genomianalyysiohjelmisto pystyy käsittelemään. Vuonna 2011 National Biodefense Analysis and Countermeasures Centerin ( USA ) tutkijat käyttivät lyhyitä lukemia, jotka saatiin sekvensoinnin aikana toisen sukupolven Illumina- ja Roche 454 -instrumenteilla korjatakseen virheet PacBio RS -sekvensserin luomissa pitkissä lukemissa. Testattuaan kehitettyä algoritmia Escherichia coli -bakteerin ja hiivan genomeilla sekä maissin transkriptillä tutkijat havaitsivat, että kokoonpanotarkkuutta voidaan nostaa 83:sta 99,9 prosenttiin. Tiedemiehet sovelsivat myös kehitettyä hybridisäätömenetelmää aiemmin sekvensoimattoman untuvähkön genomin kokoamiseen [ 8] .
Vuonna 2012 hybridilähestymistapaa käytettiin kokoamaan vuoden 2010 Haitin epidemian aiheuttaneen kolerakannan genomi . Taudin hoidon kannalta tärkeitä bakteerigenomin alueita on kerätty yli 99,9 %:n tarkkuudella [9] .
Sama DNA-molekyyli voidaan sekvensoida itsenäisesti uudelleen käyttämällä pyöreää DNA-templaattia ja entsyymiä, joka erottaa vasta syntetisoidun DNA-juosteen templaatista. Tämä on tärkeää erilaisten sairauksien analysoinnissa ja diagnosoinnissa. Vertaamalla miljoonia ja miljardeja lukemia alkuperäiseen tekstiin, saat täydellisen luettelon tutkitun genomin ja "kultastandardin" välisistä eroista . Lisäksi, jos jokainen lähdetekstin kirjain varmistetaan useilla lukemilla, tämä lisää löydettyjen geneettisten piirteiden ja poikkeavuuksien tilastollista merkitystä [10] .
Pacific Biosciencesin tutkijat yhdessä muiden organisaatioiden asiantuntijoiden kanssa käyttivät tätä lähestymistapaa perustellakseen hypoteesia FLT3:n aktivoivasta tandem - kaksoinnista terapeuttisena kohteena akuutissa myelooisessa leukemiassa [10] . Tämä tekniikka soveltuu myös transkriptianalyysiin ja silmukointiin , koska yksittäinen pitkä luku sekvensseristä voi sisältää kokonaisen mRNA:n . Yhden molekyylin reaaliaikainen sekvensointi mahdollistaa yhden nukleotidin polymorfismien havaitsemisen suurella tarkkuudella [11] .
Polymerointireaktion kinetiikka sekvensoinnin aikana mahdollistaa tärkeimpien epigeneettisten DNA-muunnosten määrittämisen . Yksimolekyylisessä reaaliaikaisessa sekvensoinnissa metyloituneiden nukleotidien läsnäolo arvioidaan seuraavaan välähdyksen välisen ajanjakson muutoksen perusteella, koska metylaatio vaikuttaa polymeraasin aktiivisuuteen. Tätä menetelmää käytetään jo metyyliadeniinin , metyylisytosiinin sekä 5-hydroksimetyylisytosiinin [12] [13] [14] määrittämiseen . Vuonna 2012 ryhmä tutkijoita käytti tätä lähestymistapaa analysoidakseen kuuden bakteerin täydellistä metylaatioprofiilia [15] .
SMRT-teknologia mahdollistaa RNA -sekvensoinnin käyttämällä käänteiskopioijaentsyymiä DNA-polymeraasin sijasta . Tällä tavalla on mahdollista havaita samanaikaisesti sekvenssi, emäsmodifikaatiot, permutaatiot, jotka vaikuttavat RNA:n rakenteeseen. Käänteistranskription kinetiikka on myös herkkä RNA:n sekundaarirakenteelle, mikä lisää pitkien taukojen tai lopettamisen todennäköisyyttä reaktion aikana. Lisäksi SMRT-sekvensointi mahdollistaa RNA:n uudelleenlaskostumisen dynamiikan havaitsemisen esimerkiksi retrovirusten käänteistranskription tai eksosomien aiheuttaman mRNA:n hajoamisen aikana [16] .
Pacific Biosciences|Pacific Biosciences kaupallisti SMRT-sekvensoinnin vuonna 2011 [17] sen jälkeen, kun se julkaisi toisen kokoonpanon vuoden 2010 lopulla [18] .
Huhtikuussa 2013 yhtiö julkaisi sekvensserin uuden version nimeltä "PacBio RS II", jolla on suurempi suorituskyky ja joka mahdollistaa pidemmät DNA-lukemat [19] [20] .
SMRT-sirun prototyyppi sisälsi ~3000 ZMW-solua rinnakkais-DNA-sekvensointia varten. Vuonna 2012 luotiin SMRT-soluja, joista jokainen sisälsi noin 150 000 ZMW-solua [21] .
Vuonna 2012 julkaistu uusi reagenssisarja mahdollisti lukeman pituuden pidentämisen [22] . Tällä hetkellä keskimääräinen lukupituus on noin 40 000 bp. p., maksimi - 100 000 n. n [23] .