Sliding clamp proteiinit eli sliding clamp ( eng. DNA clamp ) - proteiinit , jotka toimivat prosessiivisuuden vahvistimena DNA : n replikaatiossa .
Liukuvat puristusproteiinit ovat tärkeä osa DNA-polymeraasi III -holoentsyymiä ja estävät entsyymin dissosioitumisen DNA-templaatista. Koska nopeutta rajoittava vaihe DNA- synteesireaktiossa on DNA-polymeraasin sitoutuminen templaattiin, liukuvan puristinproteiinin läsnäolo lisää merkittävästi kasvavaan ketjuun kiinnittyneiden nukleotidien lukumäärää templaatin entsyymin kiinnittymistä kohti. Tämä johtuu siitä, että proteiini-proteiini-vuorovaikutus on vahvempi ja spesifisempi kuin polymeraasin ja DNA-templaatin välinen vuorovaikutus. Liukuvat puristinproteiinit lisäävät DNA-synteesin nopeutta jopa tuhat kertaa ei-prosessiiviseen polymeraasiin verrattuna [2] .
Sliding clamp -proteiinit ovat α+β-proteiineja, jotka kokoontuvat multimeerisiksi rakenteiksi, jotka ympäröivät kokonaan DNA:n kaksoiskierrettä, kun DNA-polymeraasi lisää nukleotideja kasvavaan juosteeseen [3] . Ne ympäröivät DNA:ta replikaatiohaarukassa ja "liukuvat" DNA:ta pitkin etenevän polymeraasin mukana. Liukumista helpottaa vesimolekyylien kerros puristimen keskihuokosessa; tämä kerros erottaa proteiinin ja DNA:n pinnan toimien voiteluaineena. Multimeerin toroidisen muodon vuoksi puristin ei voi irrota DNA:sta hajoamatta monomeereiksi .
Liukupuristinproteiineja on löydetty bakteereista , arkeista , eukaryooteista ja joistakin viruksista . Bakteereissa lukko on homodimeeri, joka koostuu kahdesta identtisestä DNA-polymeraasi III :n β-alayksiköstä , ja siksi sitä kutsutaan β-puristimeksi. Arkeoissa [4] ja eukaryooteissa hakas on kolmen PCNA -molekyylin trimeeri . Phage T4 :ssä on myös liukukiinnitys. Sitä kutsutaan gp45:ksi, ja se on rakenteeltaan samanlainen trimeeri kuin arkeinen ja eukaryoottinen trimeeri, mutta sen muodostavat monomeerit eivät osoita aminohapposekvenssihomologiaa sekä PCNA:n että β-alayksiköiden kanssa [3] .
| Kuningaskunta | Liukuva puristin proteiinit | Aggregoinnin tila | Samankaltainen DNA-polymeraasi |
|---|---|---|---|
| bakteerit | DNA-polymeraasi III:n β-alayksiköt | dimeeri | DNA-polymeraasi III |
| Archaea | PCNA arkealainen | trimmeri | DNA-polymeraasi e |
| eukaryootit | PCNA | trimmeri | DNA-polymeraasi δ |
| Virukset | gp43/gp45 | trimmeri | RB69 DNA-polymeraasi / T4 DNA-polymeraasi |
Kuten jo mainittiin, bakteereissa liukukiinnike on DNA-polymeraasi III -holoentsyymin (β-clamp) kahden β-alayksikön dimeeri . Kaksi β-alayksikköä on koottu DNA:n ympärille y-alayksikön ja ATP :n hydrolyysin energian avulla . Kun dimeeri on koottu DNA:n ympärille, β-alayksiköiden affiniteetti y-alayksikköä kohtaan korvataan a- ja e-alayksiköiden affiniteetilla; tällä tavalla muodostuu täydellinen holoentsyymi [6] [7] [8] . DNA-polymeraasi III on tärkein entsymaattinen kompleksi, joka osallistuu DNA:n replikaatioon bakteereissa.
DNA-polymeraasi III:n γ-kompleksi, jonka muodostavat γδδ'χψ-alayksiköt, katalysoi ATP:n hydrolyysiä ja ohjaa tuloksena olevan energian DNA:n ympärillä olevan β-dimeerin kokoamiseen, toimien siten chaperonina . Kun β-dimeeri on sitoutunut DNA:han, se voi liukua vapaasti DNA:n kaksoiskierrettä pitkin. α-alayksikkö tarjoaa DNA-polymeraasin polymeraasiaktiivisuuden ja e-alayksikkö näyttelee 3'-5'- eksonukleaasin roolia [8] .
Bakteerien DNA-polymeraasi III:n β-alayksikkö koostuu kolmesta topologisesti ei-ekvivalenttisesta domeenista (C-terminaalinen, keskus- ja N-terminaalinen). Nämä kaksi β-alayksikköä ovat tiiviissä vuorovaikutuksessa toistensa kanssa muodostaen suljetun renkaan DNA:n kaksoiskierteen ympärille.
Eukaryooteissa liukukiinnike koostuu DNA-polymeraasin δ spesifisistä alayksiköistä, joita kutsutaan proliferoivaksi solun ydinantigeeniksi ( PCNA ) . PCNA:n C-terminaaliset ja N-terminaaliset domeenit ovat topologisesti identtisiä. Kolme PCNA-molekyyliä ovat tiiviissä vuorovaikutuksessa toistensa kanssa muodostaen suljetun renkaan DNA:n kaksoiskierteen ympärille.
PCNA :n aminohapposekvenssi on melko konservoitunut eläinten ja kasvien keskuudessa . Tämä havainnollistaa luonnollisen valinnan painetta säilyttää rakenne ja vahvistaa myös, että tämän tyyppinen DNA:n replikaatio on yhteinen kaikille eukaryooteille [10] .
PCNA: lle homologisia proteiineja on tunnistettu myös arkeista ( Euryarchaeota ja Crenarchaeota ), Paramecium bursaria Chlorella-viruksesta 1 (PBCV-1) ja ydinpolyhedroosiviruksista .
Viruksen liukuvan puristinproteiinin alayksikkö gp45 sisältää 2 domeenia. Jokainen domeeni koostuu kahdesta α-kierteestä ja kahdesta β-kerroksesta. Siten tämä alayksikkö sisältää 2 topologisesti identtistä laskosta ja sillä on sisäinen pseudosymmetria niiden suhteen. 3 gp45-molekyyliä ovat tiiviissä vuorovaikutuksessa toistensa kanssa muodostaen suljetun renkaan DNA:n kaksoiskierteen ympärille [12] .
Sliding clamp -proteiinit kuljetetaan vastaavaan DNA:n kaksoiskierteeseen spesifisellä proteiinilla, joka tunnetaan nimellä replikaatiotekijä C (sliding clamp protein loader proteins [13] ), joka myös purkaa vetoketjukompleksin replikaation päätyttyä. Näiden initiaattoriproteiinien (loaderit) sitoutumiskohdat menevät päällekkäin DNA-polymeraasin sitoutumiskohtien kanssa, joten vetoketjuproteiineja ei voi sitoutua samanaikaisesti sekä lataajiin että DNA-polymeraasiin. Siksi vetoketjukompleksi ei hajoa niin kauan kuin ne pysyvät sitoutuneina DNA-polymeraasiin. Liukuvat puristusproteiinit sitoutuvat myös muihin DNA:n ja genomin homeostaasin ylläpitämiseen liittyviin tekijöihin, kuten nukleosomien kokoamistekijöihin , Okazaki-fragmentteja yhdistäviin ligaaseihin ja DNA:n korjausproteiineihin . Kaikissa näissä proteiineissa kiinnitysproteiinien sitoutumiskohdat menevät myös päällekkäin lataajan sitoutumiskohtien kanssa. Tämä varmistaa myös, että kiinnitintä ei pureta, kun jokin näistä entsyymeistä vielä toimii. Loader-proteiinit vaativat ATP-hydrolyysin energiaa DNA:n ympärillä olevien vetoketjuproteiinien sulkemiseksi.
| DNA kopiointi | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Initiaatio |
| ||||||
| Pidentymä |
| ||||||
| Irtisanominen |
| ||||||