Muinainen DNA - sekvensointi ( latinasta sequentum "sekvenssi") - nukleotidisekvenssin määrittäminen suhteessa DNA -molekyyleihin, jotka on uutettu muinaisista biologisista näytteistä, kuten paleontologisista ja arkeologisista löydöistä, muumioituneista jäännöksistä, kuivatuista kasvijäännöksistä, koproliiteista . Muinaisen DNA:n sekvensoinnilla saatujen nukleotidisekvenssien analyysi mahdollistaa lajien välisten fylogeneettisten suhteiden selvittämisen ja hypoteesien testaamisen ympäristön muutosten ja populaatioiden evoluutiomuutostenja antaa myös tietoa molekyylikellojen kalibroinnista [1] .
Muinaisen DNA:n kanssa työskennellessä tutkijat kohtaavat monia näytteiden säilytykseen liittyviä ongelmia. DNA voi hajota ajan myötä kemiallisesti modifioituna. Jäännösten hajoamiseen osallistuvat mikro-organismit eivät vain loukkaa kudosten eheyttä , vaan myös tuovat oman DNA:nsa näytteeseen, mikä vaikeuttaa muinaisen DNA:n uuttamisprosessia ja saatujen tietojen bioinformatiikkaa . Menetelmät, kuten seuraavan sukupolven sekvensointi ja DNA-kirjastojen rikastaminen hybridisaatiolla , voivat merkittävästi lisätä näytteistä saatavan tiedon määrää.
DNA-analyysi suoritettiin useista muinaisista eläimistä, mukaan lukien mammutista ja luolakarhusta . Ihmisjäännösten DNA-analyysi mahdollisti uuden muinaisten ihmisten ryhmän - Denisovans - tunnistamisen sekä paljastaa yksityiskohtia nykyaikaisten etnisten ryhmien alkuperästä. Patogeenien muinaisen DNA:n analyysin tuloksena tehtiin lukuisia löytöjä: 1300-luvun Lontoon hautauksista peräisin olevan ruttobasillin genomista ja 1800-luvun näytteistä fytophthora -sienen genomia tehtiin analyysi.
Muinaisen DNA:n tutkimukset alkoivat vuonna 1984 sekvensoimalla mitokondriaalisen DNA:n (mtDNA) fragmentti quaggasta , Burchellin seepran alalajista , joka kuoli sukupuuttoon 1800-luvun jälkipuoliskolla [2] . DNA:n ei ole vain havaittu säilyvän yli puolitoista vuosisataa, vaan se voidaan myös osittain eristää ja sekvensoida. Pian tämän jälkeen Svante Paabo sekvensoi ihmismuumioista saatuja näytteitä. [3] [4] Näissä tutkimuksissa tiedemies käytti bakteerikloonausta DNA - fragmenttien monistamiseen . Kävi ilmi, että suurin osa näytteissä olevasta DNA:sta on bakteeri- tai sienialkuperää, ja monistuttava endogeeninen DNA koostuu pääasiassa lyhyistä vaurioituneista monikopiolokusten fragmenteista (esim. mtDNA) ja muodostaa pienen osan tutkitusta DNA:sta. Polymeraasiketjureaktion (PCR) keksiminen mahdollisti jopa muutaman jäljellä olevan DNA-fragmentin monistamisen ja antoi sysäyksen tämän alan kehitykselle, mutta lisäsi myös tulosten herkkyyttä kontaminaatiolle [5] .
Muinaisen DNA:n tutkiminen on tärkeää sellaisille tieteenaloille kuin genetiikka , paleotoologia , paleoepidemologia , antropologia (erityisesti paleoantropologia ) ja arkeologia . Myös tästä alueesta on tullut osa paleogenetiikan metodologiaa .
Muinaisen DNA:n analyysillä voidaan arvioida pitkään sukupuuttoon kuolleiden tai suuresti muuttuneiden organismien taksonomisten ryhmien evoluutionaalista läheisyyttä, joiden spesifisiä suhteita on äärimmäisen vaikea saada muulla tavalla selville. Tässä kiinnitetään erityistä huomiota alueisiin, joilla on suuri vaihtelu – DNA:n alueisiin, joilla mutaatioita esiintyy usein. Erityisesti nämä ovat lyhyitä tandemtoistoja (STR) ja yhden nukleotidin polymorfismeja (SNP). Mitokondrio-DNA:n analyysi antaa tarkempaa tietoa tämän menetelmän yhteydessä, koska mitokondrio-DNA:lla on paljon suurempi määrä kopioita verrattuna tuma-DNA:han (noin 1000 kopiota mitokondrio-DNA:ta ja 2 kopiota tuma-DNA:ta per solu) [6] .
Muinaisen DNA:n analyysi mahdollistaa myös sellaisten lajien luuston jäänteiden sukupuolen määrittämisen, joiden naaras- ja urosyksilöt eroavat sukupuolikromosomijoukossa, mikä on erityisen tärkeää silloin, kun muut menetelmät, kuten antropometria , eivät pysty antamaan tarkkaa vastausta [7 ] .
Tätä menetelmää voidaan soveltaa myös paleoepidemologian yhteydessä. On äärimmäisen vaikeaa diagnosoida sairauksia luurankojäännöksillä ja tutkia muinaisia pandemioita ilman, että analysoidaan potilaiden jäännöissä säilyneiden taudinaiheuttajien DNA:ta. Sellaiset tutkimukset tulivat mahdollisiksi vasta 1990-luvulla, jolloin pystyttiin jäljittämään sekä tarttuvien bakteerikantojen ja virusten kehitystä ja niiden leviämistä sekä verrata jäännöksistä havaittuja taudin oireita nykyajan tietoon tietystä sairaudesta [ 8] [9] .
Normaalisti organismin kuoleman jälkeen endogeeniset nukleaasit pilkkovat DNA:ta . Näin ei tapahdu, jos nukleaasit tuhoutuvat nopeasti tai inaktivoituvat esimerkiksi jäännösten kuivumisen, alhaisten lämpötilojen tai korkeiden suolapitoisuuksien vuoksi. [10] Siitä huolimatta DNA vaurioituu ajan myötä vahingossa tapahtuvan hydrolyysin tai hapettumisen seurauksena . Hydrolyyttisiä vaurioita ovat ketjun fosfaattirungon tuhoutuminen, depurinaatio (vastaava asema jää ilman typpipitoista emästä) ja deaminaatio . Useammin sytosiini deaminoituu urasiiliksi, metyloitu sytosiini (5-metyylisytosiini) deaminoituu tymiiniksi ; harvemmin adeniini muuttuu hypoksantiiniksi , joka täydentää sytosiinia tymiinin sijaan, mikä johtaa sekvensointivirheisiin. Näitä vaurioita esiintyy myös elävissä soluissa, mutta siellä ne eliminoituvat korjausprosessissa . Lisäksi DNA-kierteen säikeiden välillä esiintyy ristisidoksia, jotka johtuvat DNA:n alkyloinnista tai silloittumisesta eri molekyyleihin Maillardin reaktiolla . Kuten ketjun katkeaminen, ristisilloitukset häiritsevät PCR-monistusta [5] [10] . Ennen sekvensointia muinaiselle DNA:lle tehdään erityiskäsittely deaminaatiotuotteiden ja ristisidosten poistamiseksi. Muinaisen DNA:n monistettujen fragmenttien keskipituus ei usein ylitä 100 emäsparia, ja samalta kaivauspaikalta peräisin olevien löydösten osalta fragmenttien keskimääräinen pituus pienenee löydön iän myötä. Nykyiset muinaiset DNA-sekvensointiprotokollat ottavat tämän ominaisuuden huomioon; erityisesti sen sijaan , että alukkeet kiinnitettäisiin DNA-fragmentteihin, adapterit kiinnitetään fragmenttien päihin, ja adaptereille komplementaariset oligonukleotidit toimivat alukkeina [ 11] .
Alhaisissa lämpötiloissa DNA:n hajoaminen on hitaampaa, mikä varmistaa DNA:n hyvän säilymisen ikirouta-alueelta löytyvissä näytteissä. Uskotaan kuitenkin, että edes ihanteellisissa olosuhteissa DNA ei voi säilyä yli miljoona vuotta [5] [10] .
Usein kontaminaatiosta tai kontaminaatiosta johtuen vain pieni osa näytteen DNA:sta on endogeenistä alkuperää. Tässä suhteessa parhaat näytteet sisältävät jopa 90 % endogeenistä DNA:ta. [yksi]
Arkeologiset näytteet sisältävät aina DNA:ta bakteereista ja sienistä, jotka kolonisoivat jäännöksiä niiden ollessa maassa. Lisäksi muinaisen DNA:n tutkimisen yhteydessä näytteeseen voi päästä ihmisen tai mikrobien DNA:ta, jota on läsnä missä tahansa laboratoriossa. Toisin kuin muinainen DNA, nykyaikainen DNA monistuu hyvin PCR:llä. Monistettua modernia DNA:ta sisältävät PCR-tuotteet voivat levitä kaikkialle laboratorioon ja siten lisätä kontaminaatioastetta [1] [5] . Laboratoriokontaminaation estämiseksi suositellaan laitteiden pitkäaikaista käsittelyä ultraviolettisäteilyllä tai hapolla ja PCR-laboratorioiden työprotokollan vaatimusten noudattamista. Muinaisen DNA:n tutkimusta ei pidä tehdä laboratoriossa, jossa on aiemmin tutkittu nykyaikaisia näytteitä, erityisesti sukulaislajeja [5] . Monet arkeologiset näytteet, erityisesti ne, jotka löydettiin ennen nykyaikaisten molekyylibiologisten menetelmien tuloa, ovat saastuneet louhinnan ja tutkimuksen aikana. Jos näyte löydettiin vuosikymmeniä sitten, sen saastuttamassa ihmisen DNA:ssa voisi olla kaikki muinaisen DNA:n tunnusmerkit. Luissa ja hampaissa on huokoinen pinta, mikä vaikeuttaa niiden puhdistamista nykyaikaisesta DNA:sta. Hiukset osoittautuvat tässä suhteessa edullisemmiksi: sen sisältämä DNA on tuskin bakteerien ulottuvilla, ja hydrofobinen pinta mahdollistaa sen puhdistamisen ennen DNA:n uuttamista [1] . Tässä tapauksessa näytteen eri osien (esimerkiksi reidet ja hampaat) eri laboratorioissa tehdyn riippumattoman tutkimuksen tuloksena saatujen sekvenssien yhteensopivuus todistaa tuloksen totuuden puolesta [5] .
Ihmisjäännösten tapauksessa nykyihmisen DNA:n kontaminaatio voi johtaa virheisiin fysiologian ja populaatiogenetiikan tutkimuksessa . On olemassa tilastollinen menetelmä, joka mahdollistaa muinaisen DNA:n erottamisen nykyaikaisesta DNA:sta deaminaatiomallin perusteella [12] [13] . Jos DNA-näytteen tiedetään kuuluvan naiselle, sekvensoidut sekvenssit voidaan kartoittaa Y-kromosomiin ja siten havaita miehen DNA:n sisäänpääsy näytteeseen [14] . Jos ei-ihmisperäistä DNA:ta tutkitaan, ilmeinen tapa tarkistaa kontaminaatio on kartoittaa sekvensointilukemat ihmisen genomiin sekä muiden organismien genomiin siltä varalta, että ne voivat olla kontaminaatiolähteitä. Muinaista bakteeri-DNA:ta sekvensoitaessa ongelmana on myös se, että läheskään kaikkien tällä hetkellä olemassa olevien bakteerien genomit tunnetaan, joten siitä, että tuloksena oleva sekvenssi ei sisälly tunnettuihin bakteerigenomeihin, ei voida päätellä sen kuuluvan muinaiseen bakteerigenomeen. bakteeri, eikä sitä saatu kontaminaation seurauksena [5] .
Mitokondrio- ja plastidi -DNA- insertit löytyvät usein ydin-DNA:sta. Muinaisia DNA-näytteitä tutkittaessa organellien DNA:ta ei voida eristää, joten nämä insertit voivat olla virheen lähde, koska niitä ei aina ole helppo erottaa sekvenssin perusteella todellisesta mtDNA:sta tai cpDNA:sta. Jos tällaiset insertit erehtyvät erehtymään organellien DNA:han, tämä voi vääristää fylogia- tai populaatiogenetiikan tutkimuksen tuloksia [5] .
Muinaisen DNA:n lähteenä he yrittävät usein käyttää säilyneitä kehon osia, jotka eivät ole kovin kiinnostavia anatomisen rakenteen kannalta. Yllä kuvatuista prosesseista johtuen useimmissa muinaisissa näytteissä tutkijoita kiinnostavan muinaisen DNA:n pitoisuus on hyvin pieni - vain noin 1%. Tämä määrä vaihtelee suuresti riippuen näytteen luonteesta. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että paljon suurempi endogeenisen DNA:n saanto ihmisen esi-isien jäännöksistä saavutetaan eristämällä materiaalia hampaista ja ohimoluun kivestä . [viisitoista]
Ensimmäinen vaihe on jauhaa näyte ja eristää DNA. Luun jäännösten tapauksessa käytetään hiekkapuhalluspistooleja tai erikoisporakoneita ensisijaiseen sirpalointiin. Lisäksi hiukkaset murskataan edelleen (jauhemaiseen tilaan) sekoitusmyllyissä. Jauhe käsitellään peräkkäin joukolla reagensseja ja sentrifugoidaan DNA:n puhdistamiseksi mineraaleista ja muista epäpuhtauksista [16] .
Seuraava vaihe on DNA-kirjastojen tuotanto ja niiden rikastaminen hybridisaatiolla [17] . Nukleotidisekvenssin suora saaminen suoritetaan seuraavan sukupolven sekvensoinnilla .
Vuonna 2012 Methods of Molecular Biology -lehdessä julkaistussa artikkelissa esiteltiin mahdollisia menetelmiä muinaisen DNA:n eristämiseksi säilötyistä kasvinäytteistä. Kuten muinaisen eläimen DNA:n tapauksessa, paleokasvien näytteet säilyvät ehjinä tähän asti, mikä johtuu usein jäähtymisestä laajamittaisten jäätiköiden aikana [18] .
"Antediluvian" (eng. antediluvian ) kutsuttiin DNA:ksi, joka on vanhempi kuin miljoona vuotta. Tomas Lindahl ehdotti nimeä vuonna 1993 Nature-julkaisussa [ 19] . 1990-luvulla ilmestyi raportteja miljoonia vuosia säilyneen DNA:n sekvensoinnista kasvien fossiileissa, dinosaurusten luissa ja meripihkan inkluusioissa . Jotkut näistä tuloksista ovat erittäin todennäköisiä kontaminaatioiden vuoksi, kun taas toiset eivät olleet toistettavissa. [5] [10] Esimerkiksi vastauksena Science -lehdessä julkaistuun julkaisuun mitokondrion DNA-fragmentin sekvensoinnista liitukauden dinosauruksen luusta (80 miljoonaa vuotta sitten), julkaistiin muistiinpanoja, joista yksi osoitti, että kun rakennettiin fylogeneettinen puu, sekvenssi dinosauruksen luuryppyistä, joissa on pikemminkin ihminen kuin lintujen tai krokotiilien ortologinen mtDNA-alue, mikä osoittaa saastumisen suuren todennäköisyyden [20] ; toinen huomautus ehdotti [21] , että dinosauruksesta johtuva sekvenssi on itse asiassa muinainen mtDNA-insertio ihmisen kromosomissa, joka löydettiin näytteestä [22] .
Hyvin säilyneet näytteet mahdollistavat osittaisen ja joissakin tapauksissa jopa täydellisen ydingenomin sekvensoinnin . Vuonna 2008 DNA sekvensoitiin kahden mammutin villasta, jotka kuolivat noin 20 000 ja 59 000 vuotta sitten. Kartoitus afrikkalaisen norsun genomin luonnokseen mahdollisti endogeenisen DNA:n osuuden arvioinnin näissä näytteissä 90 %:ksi ja 58 %:ksi; suurin osa kontaminaatiosta molemmissa tapauksissa oli bakteeri-DNA:ta ja sekvenssejä, joiden alkuperää ei voitu määrittää. Saatujen tietojen avulla oli mahdollista arvioida mammutin ja afrikkalaisen norsun eroamisaika 7,5 miljoonaksi vuodeksi ja mammutin kahden sukupolven eroaika, josta näytteet otettiin, 1,5-2 miljoonaa vuotta. . Samaan aikaan mammuttien sekvensoitu DNA vastaa norsujen DNA:ta 99,41 % nukleotiditasolla ja 99,78 % aminohappotasolla (eli ero on noin 1 tähde proteiinia kohti). M4:n ja M25:n kuuluminen eri kladeihin määritettiin aiemmin mitokondrioiden DNA -sekvensoinnin perusteella, ja uusi arvio poikkeamisajasta on yhdenmukainen mtDNA-estimaatin kanssa ja tarkentaa sitä. Yksi mammuttisekvensoinnin tavoitteista oli tunnistaa toiminnallisesti tärkeitä aminohappoeroja mammutin ja norsun välillä. Näiden lajien välillä valittiin 92 eroa, joilla voi olla toiminnallista merkitystä, ja joista osa on saattanut olla positiivisen valinnan alla [23] .
Yhdessä aikaisemmassa tutkimuksessa näytteiksi otettiin kahdeksan mammutin jäänteet Khatangan Mammoth Museumista, jotka olivat hyvin säilyneet alhaisissa lämpötiloissa. Parhaaksi valituksi näytteeksi 45,4 % DNA-fragmenteista asettui elefantin genomin kokoonpanoon, ja elefantin ja mammutin DNA:n samankaltaisuus oli 98,55 % ilman, että deaminaatiosta johtuvia eroja oli mukautettu [24] .
Vuonna 2013 saatiin luonnosversio muinaisesta hevosen genomista [25] . Näytteen iän arvioidaan olevan 560-780 tuhatta vuotta. Vuoden 2013 lopussa tämä on vanhin täydellinen ydingenomi. Sekvensoitiin myös myöhäispleistoseenin (~43 tuhatta vuotta sitten) hevosen, viiden nykyaikaisen hevosrodun, Przewalski-hevosen ja aasin DNA. Fylogeneettinen analyysi osoitti, että koko Horse -suvun viimeinen yhteinen esi-isä eli 4-4,5 miljoonaa vuotta sitten, mikä osoittautui kaksinkertaiseksi aiemmin hyväksyttyyn arvioon verrattuna; Przewalskin hevosen ja kotihevosen esi-isien populaatiot erosivat 38-72 tuhatta vuotta sitten. Samana vuonna 179–680 tuhatta vuotta sitten keskipleistoseenissa eläneen espanjalaisen luukarhun mitokondriaalinen DNA-sekvenssi palautettiin , ja muinaisen DNA:n sekvensointia varten valmistettu tekniikka optimoitiin lukemisen parantamiseksi. lyhyistä (30–50 bp) fragmenteista [11] . Lokakuusta 2013 lähtien muinainen genomi on sekvensoitu useammalla kuin yhdellä kattavuudella vain selkärankaisille, kuten ihmisille, jääkarhuille ja hevosille.
Ensimmäinen askel neandertalilaisten geneettisen materiaalin tutkimisessa oli työskennellä mitokondriaalisen DNA:n kanssa, joka oli eristetty luista, jotka löydettiin vuonna 1856 Neandertalin laaksosta (Saksa). Vuonna 2006 aloitettiin projekti neandertalin täydellisen genomin sekvensoimiseksi . Teoksessa käytettiin DNA:ta Kroatiasta Vindia-luolasta sekä muutamista muista luista. Saatu genomin kohdistaminen modernin ihmisen genomin ja simpanssin genomin kanssa mahdollisti karkeasti arvioiden nykyihmisen ja neandertalilaisten eroamisajan olevan 270-440 tuhatta vuotta olettaen, että ihmiset ja simpanssit erosivat 6,5 miljoonaa vuotta sitten [26] . Sidrone-luolasta (Espanja), -luolasta Saksa) ja -luolasta (Venäjä) peräisin olevien neandertalilaisten genomit eroavat hieman ensimmäisestä.
Muinaisten ihmisten DNA-sekvensointi tarjoaa toivoa tunnistaa toiminnallisia genomimutaatioita, jotka erottavat muinaiset ihmiset apinoista, sekä jäljittää nykyihmisen ja muinaisen ihmisen välisiä eroja. Tutkimus paljasti yllättävän pienen määrän kiinteitä substituutioita genomissa melko pitkän ajan kuluessa. Vain 5 geeniä löydettiin, joissa nyky-ihmisessä kirjattiin useampi kuin yksi substituutio, joka muutti proteiinin rakennetta (verrattuna neandertaliläiseen, joka osui sampanssien kanssa näissä lokuksissa): RPTN , SPAG17, CAN15, TTF1 ja PCD16.
Neandertalin ja nykyihmisen SNP :n monimuotoisuuden vertailu mahdollistaa positiivisen valinnan kohteiden paikallistamisen genomissa. Suurin sellainen genomin alue, joka on tunnistettu SNP-erojen analysoinnilla, kuuluu THADA-geeniin sen välittömässä ympäristössä olevat SNP t liittyvät tyypin 2 diabetekseen, ja tämän geenin ilmentyminen vaihtelee merkittävästi diabeetikkojen ja terveiden ihmisten välillä. Samalla alueella ihmisen genomista löydettiin 9 nukleotidin insertio, joka puuttuu kaikista tunnetuista genomeista hiiristä kädellisiin ja neandertalilaisiin. Myös muiden alueiden SNP:t liittyvät skitsofreniaan , Downin oireyhtymään ja autismiin . Kiinnostava on RUNX2-geeni joka tällä hetkellä tunnettu geeni, joka liittyy clavicular-kraniaalisen dysostoosin kehittymiseen . SNP-analyysi paljastaa myös neandertalilaisten geneettisen materiaalin sekoittumisen ei-afrikkalaisten DNA:han, mikä vahvistaa teorian, jonka mukaan neandertalilaiset risteytyivät nykyihmisen kanssa, mikä tapahtui jälkimmäisen väestön vapautumisen jälkeen Afrikasta.
Juuri muinaisen DNA:n analyysi mahdollisti tämän tyyppisten muinaisten ihmisten löytämisen - alun perin uskottiin, että Denisovan luolasta löydetyt luuston fragmentit (kaksi sormen sormia ja kolme poskihampaa) kuuluivat neandertaleille. Jäännösten mitokondriaalinen DNA - sekvensointi kumosi teorian ja osoitti niiden kuuluvan erilliseen ryhmään. Ero Denisovan ja nykyihmisen välillä on 2 kertaa suurempi kuin ero neandertalilaisten ja nykyihmisen välillä, mutta ydin-DNA:ssa nämä erot ovat samaa luokkaa. Mahdollinen selitys on, että denisovalaiset ja neandertalilaiset polveutuvat yhteisestä esi-isästä, joka oli aiemmin eronnut tulevaisuuden nykyihmisen haarasta. Tämä hypoteesi vahvistettiin vertaamalla kahta muinaisten ihmisten genomia (denisovetit, neandertalilaiset) ja viittä nykyihmisten genomia (Ranskan, Kiinan, Papua-Uuden-Guinean edustajat , afrikkalaiset jorubat ja bushmenit ) sekä linjaus. denisovan, neandertalin ja joruban afrikkalaisten genomit simpanssien genomissa . Lisäksi tutkimus osoitti, että denisovalaiset ja neandertalilaiset ovat sisarryhmiä. On myös osoitettu, että denisovalaiset, kuten neandertalilaiset, risteytyvät joidenkin nykyihmisten ei-afrikkalaisten populaatioiden kanssa: neandertalilaisten DNA:n seos on läsnä kaikissa ei-afrikkalaisissa ryhmissä, ja denisovalaisten seos papualaisilla ja melanesalaisilla [14] . .
Tuma- ja mitokondrio-DNA-tietoihin perustuvat fylogeneettiset johtopäätökset poikkeavat toisistaan. Tämä saattaa selittyä sillä tosiasialla, että Denisovanin mtDNA on peräisin jostain muinaisesta sukulinjasta, joka ei juurtunut neandertalilaisiin ja nykyajan ihmisiin. Muinaisten populaatioiden suuri koko tekee tämän hypoteesin uskottavan, vaikka vieläkään ei ole tarpeeksi tietoa tämän ongelman yksiselitteiseen ratkaisemiseen.
Luuluolasta peräisin olevan heidelbergilaisen miehen lähes täydellisen mitokondriogenomin analyysi mahdollisti löydön iän arvioimisen 150-640 tuhanneksi vuodeksi ja osoitti, että mitokondriogenomit ovat samankaltaisempia Heidelbergin miehellä ja Denisovanilla. nämä lajit ja neandertalilaiset, vaikka luuluolasta kotoisin olevat ihmiset ovat morfologisesti samanlaisia kuin neandertalilaiset. Mahdollisia selityksiä on useita. Luuluola-ihmiset voivat edustaa ryhmää, joka on erillinen sekä neandertalilaisista että denisovalaisista, jotka vaikuttivat Denisovan mtDNA:han, mutta tämä versio ei selitä neandertalilaisten morfologisia piirteitä lajissa, joka ei ole heille suoraan sukua. Toinen mahdollinen selitys on, että heidelbergilaiset ovat sukua neandertalilaisten ja denisovanlaisten yhteisille esivanhemmille, mutta tämä versio viittaa siihen, että tässä ryhmässä on kaksi erittäin erilaista mtDNA-sukulinjaa, jotka ovat esi-isiä neandertalilaisten ja denisovanien välillä. Kolmanneksi ei voida sulkea pois sellaisten vähän tutkittujen ihmisen alalajien vaikutusta, jotka voisivat edistää Heidelbergin kansan ja Denisovanin mtDNA:ta. Ydin-DNA-analyysi voi selventää kuvaa [27] .
Tietoa sytosiinin metylaatiosta CpG : ssä voidaan hakea suoraan sekvensointitiedoista 28Deaminaatio , joka tapahtuu satunnaisesti ajan myötä, muuttaa metyloimattoman sytosiinin urasiiliksi ja metyloidun sytosiinin tymiiniksi . Muinainen DNA-sekvensointiprotokolla sisältää DNA:n käsittelyn urasiili-DNA-glykosylaasilla ja endonukleaasi VIII:lla, minkä seurauksena urasiili poistetaan ja DNA -molekyyli murtuu sopivasta paikasta poistamalla vaurioitunut nukleotidi [29] . Tämän seurauksena sekvensoitaessa niitä kohtia, joissa sytosiini oli metyloitunut, saadaan suuri prosenttiosuus lukemista T:n kanssa, ja metyloitumaton sytosiini luetaan C:ksi niille molekyyleille, joissa ei tapahtunut deaminaatiota tässä kohdassa.
4000 vuotta vanhojen paleoeskimojäänteiden hiuksista erotetun DNA-sekvenssin perusteella pystyttiin rakentamaan genomin laajuinen kartta nukleosomien sijainnista ja metylaatiosta [30] , ja metylaatioprofiili selvisi. olla lähellä nykyihmisen hiuksissa havaittua.
Metylaatiokartta on myös rekonstruoitu neandertalilaisille ja denisovaneille [28] [31] . Niiden metylomi osoittautui samankaltaiseksi kuin nykyihmisellä, erityisesti "kodinhoito" -geenialueella , mutta noin 2000 alueelta löydettiin merkittäviä eroja metylaatiossa . Varsinkin muinaisilla ihmisillä HOXD- klusterista löydettiin merkittyjä alueita, jotka osallistuivat raajojen kehityksen säätelyyn, mikä voi selittää sellaiset anatomiset erot heidän ja nykyihmisten välillä, kuten lyhyemmät raajat, suuret kädet , leveät kyynär- ja polvinivelet [28] ] [31] .
Nykyaikaiset muinaisen DNA:n uuttamis- ja sekvensointimenetelmät antavat meille mahdollisuuden tutkia taudinaiheuttajia, jotka on saatu tautiin pitkään kuolleiden ihmisten jäänteistä. Saatujen näytteiden fylogeneettinen analyysi mahdollistaa patogeenisten organismien evoluution palauttamisen. Ruttobasillin ja Hansenin basillin keskiaikaiset kannat sekä 1800 -luvulta peräisin oleva Kochin basillikanta on sekvensoitu.
Ruttobasillin ( Yersinia pestis ) muinaisen DNA:n tutkimukset , jotka on saatu mustan kuoleman uhrien hautauksista Lontoossa , osoittivat, että tuon ajan ruttobasilli, lukuun ottamatta tälle lajille ominaisia mahdollisia genomisia uudelleenjärjestelyjä ja rajoittui yhteen nukleotidiin polymorfismit , erosivat vähän nykyisistä kannoista. Lisäksi kaikki polymorfismit, jotka erottavat sen modernista kannasta, sisälsivät muunnelman ruttobacilluksen esi-isästä - Y. pseudotuberculosis . Nämä tiedot viittaavat siihen, että muinaisen ruttobasillin genotyyppi ei ollut pääsyy sen korkeaan virulenssiin tuolloin ja kenties sen osuus oli yhtä suuri kuin sellaisten tekijöiden osuus, kuten kantaja-aineiden geneettisesti määräytyvä herkkyys, ilmasto, sosiaalinen herkkyys. sairaudet ja vuorovaikutukset muiden sairauksien kanssa. Fylogeneettisen analyysin avulla määritettiin aikaväli, jolloin kaikkien nykyajan ihmisen patogeenisten ruttobacilluskantojen viimeinen yhteinen esi-isä eli 1282–1343, ja muinainen bakteeri oli lähimpänä fylogeneettisen puun esi-isolmua [32] . ] .
Vuonna 2013 julkaistiin merkittävä sekvensointitutkimus vanhoista taudinaiheuttajista nyt kadonneista Phytophthora infestans -kannoista , jotka aiheuttivat Irlannin perunanälän 1800- luvun puolivälissä . Näiden patogeenien geneettinen materiaali eristettiin säilötyistä perunan ja tomaatin lehdistä eri ajoilta. Toistaiseksi tietojen analysointi ei ollut mahdollista sekvensointimenetelmien puutteen vuoksi. Tutkijat analysoivat erilaisia taudinaiheuttajakantoja eristäen niihin liittyviä kantoja Irlannin, Pohjois-Amerikan ja Euroopan kasveista . Tutkimukset ovat osoittaneet, että edellä mainitun nälänhädän aiheuttaneella lajiryhmällä (HERB-1) ja Pohjois-Amerikan ryhmällä (US-1) oli viimeinen yhteinen esi-isä, oletettavasti Meksikossa 1700- ja 1800 -luvun vaihteessa .
Tämä tutkimus on erityisen mielenkiintoinen menneiden epidemioiden, sekä eläinten että kasvien patogeenien muinaisen DNA:n analyysin näkökulmasta . Tämä alue on kehityksensä varhaisessa vaiheessa, mutta jos biologisia pankkeja perustetaan systemaattisesti, tällainen tieto voi merkittävästi edistää lähitulevaisuudessa mikrobilääkkeiden etsintöjen nopeutumista, kun kyseessä ovat läheisten patogeenien aiheuttamat epidemiat [33] .