Useat biokemialliset kytkimet ohjaavat siirtymiä solusyklin eri vaiheiden välillä ja sisällä . Solusykli on sarja monimutkaisia, järjestettyjä, peräkkäisiä tapahtumia, jotka ohjaavat yhden solun jakautumista kahdeksi soluksi ja sisältää useita erillisiä vaiheita. Vaiheet sisältävät G1- ja G2-vaiheet, DNA:n replikaatio- tai S-vaiheen sekä varsinaisen solunjakautumisprosessin, mitoosin tai M-vaiheen [1] . M-vaiheen aikana kromosomit erottuvat ja sytokineesi tapahtuu.
Kytkimet ylläpitävät solusyklin hallittua kehitystä ja toimivat tarkistuspisteinä sen varmistamiseksi, että jokainen vaihe päättyy oikein ennen siirtymistä seuraavaan vaiheeseen [1] . Esimerkiksi Cdk tai sykliiniriippuvainen kinaasi on solusyklin pääsäätelijä ja mahdollistaa solun siirtymisen Gl:stä S:ään tai G2:sta M:ään lisäämällä fosfaattia proteiinisubstraatteihin. Tällaisten monikomponenttikytkimien (joihin sisältyy monia toisiinsa liittyviä proteiineja) on osoitettu synnyttävän ratkaisevia, luotettavia (ja mahdollisesti peruuttamattomia) siirtymiä ja laukaisevan stabiileja värähtelyjä [2] . Tämän seurauksena ne ovat aktiivisen tutkimuksen kohteena, jossa pyritään ymmärtämään, kuinka tällaiset monimutkaiset ominaisuudet liittyvät biologisiin valvontajärjestelmiin [2] [3] [4] .
Monet biologiset piirit tuottavat monimutkaisia lähtöjä käyttämällä yhtä tai useampaa takaisinkytkentäsilmukkaa . Biokemiallisten tapahtumien sarjassa palaute viittaa sekvenssin alavirran elementtiin (B viereisessä kuvassa), joka vaikuttaa johonkin ylävirran komponenttiin (A viereisessä kuvassa) vaikuttamaan sen omaan tuotantoon tai aktivointiin (tulostukseen) tulevaisuudessa. Jos tämä elementti toimii kasvattaakseen omaa tuottoaan, se osallistuu positiiviseen palautteeseen (sininen nuoli). Positiivinen takaisinkytkentäsilmukka tunnetaan myös itsevahvistavana silmukana, ja on mahdollista, että nämä silmukat voivat olla osa suurempaa silmukkaa, koska tämä on yleistä säätöpiireissä [1] .
Kääntäen, jos tämä elementti johtaa omaan estoonsa korkeampien elementtien kautta, tämä on kanonisesti negatiivista palautetta (punainen tylsä nuoli). Negatiivinen takaisinkytkentäsilmukka tunnetaan myös tasapainotussilmukana, ja usein voidaan nähdä värähtelyjä, joissa viivästettyä negatiivista takaisinkytkentäsignaalia käytetään ylläpitämään järjestelmän homeostaattista tasapainoa [1] .
Palautesilmukoita voidaan käyttää vahvistukseen (positiivinen) tai itsekorjaukseen (negatiivinen). Oikea positiivisten ja negatiivisten palautteiden yhdistelmä voi synnyttää yliherkkyyttä ja bistabiilisuutta [5] [6] , mikä puolestaan voi synnyttää kriittisiä siirtymiä ja värähtelyjä.
Positiivinen ja negatiivinen palautesilmukat eivät aina toimi hyvin. Biokemiallisten kytkimien mekanismissa ne toimivat yhdessä joustavan järjestelmän luomiseksi. Esimerkiksi Pfeuty & Kaneko (2009) mukaan biokemiallisten järjestelmien puutteen voittamiseksi positiivisen palautteen säätelysilmukat voivat olla vuorovaikutuksessa negatiivisten säätelysilmukoiden kanssa helpottaen toipumista stabiileista tiloista [7] . Kahden stabiilin tilan rinnakkaiselo tunnetaan bistabiliteettina, joka on usein seurausta positiivisesta palauteohjauksesta.
Esimerkki, joka paljastaa useiden negatiivisten ja positiivisten takaisinkytkentäsilmukoiden vuorovaikutuksen, on sykliiniriippuvaisten proteiinikinaasien eli Cdks14:n aktivaatio. Positiivisilla takaisinkytkentäsilmukailla on rooli vaihtaessaan soluja alhaisesta Cdk-aktiivisuudesta korkeaan. Kahden tyyppisten silmukoiden välinen vuorovaikutus ilmenee mitoosissa. Vaikka positiivinen palaute käynnistää mitoosin, negatiivinen palautesilmukka edistää sykliinistä riippuvien kinaasien inaktivointia anafaasia stimuloivan kompleksin toimesta. Tämä esimerkki osoittaa selvästi positiivisen ja negatiivisen palautteen yhteisvaikutukset solusyklin säätelyyn.
Kaikki tai ei mitään -reaktiota ärsykkeeseen kutsutaan yliherkkyydeksi . Toisin sanoen, hyvin pieni muutos ärsykkeessä aiheuttaa erittäin suuren muutoksen vasteessa, luoden sigmoidisen annos-vastekäyrän. Yliherkkyysvaste kuvataan yleisellä yhtälöllä V = S n /(S n + K m ), joka tunnetaan nimellä Hill-yhtälö , kun n, Hillin kerroin, on suurempi kuin 1. Sigmoidikäyrän kaltevuus riippuu arvosta n. Arvo n = 1 antaa hyperbolisen tai Michael-vasteen. Ultraherkkyys saavutetaan eri järjestelmissä; merkittävä esimerkki on entsyymin hemoglobiinin yhteistoiminnallinen sitoutuminen substraattiin. Koska yliherkkä vaste on melkein "digitaalinen", sitä voidaan käyttää lisäämään vastetta ärsykkeelle tai tekemään äkillinen äkillinen siirtymä ("off"- ja "on"-tilojen välillä).
Ultraherkkyydellä on tärkeä rooli solusyklin säätelyssä. Esimerkiksi Cdk1 ja Wee1 ovat mitoosin säätelijöitä ja pystyvät inaktivoimaan toisensa estävän fosforylaation kautta. Tämä on kaksinkertainen negatiivinen takaisinkytkentäsilmukka, jossa molemmat säätimet inaktivoivat toisensa. Kimin ym. (2007) mukaan on oltava ultraherkkä elementti, joka tuottaa bistabiilin vasteen. Kävi ilmi, että Wee1:llä on yliherkkä vaste Cdk1:lle, ja tämä todennäköisesti johtuu substraattikilpailusta Wee1:n eri fosforylaatiokohtien välillä [8] .
Bstabiilisuus tarkoittaa hystereesiä ja hystereesi monivakautta. Monivakaus ilmaisee kahden tai useamman vakaan tilan olemassaolon tietylle tulolle. Siksi bistabiilisuus on järjestelmän kykyä olla olemassa kahdessa stationaarisessa tilassa [9] . Toisin sanoen on olemassa joukko ärsykearvoja, joiden vasteella voi olla kaksi vakaan tilan arvoa. Bstabiilisuuteen liittyy hystereesi , mikä tarkoittaa, että järjestelmä lähestyy toista kahdesta vakaasta tilasta ensisijaisesti riippuen sen historiasta. Bstabiilisuus vaatii palautetta sekä erittäin herkän piirielementin.
Sopivissa olosuhteissa positiiviset ja negatiiviset takaisinkytkentäsilmukat voivat tarjota edellytykset bistabiiliudelle; esimerkiksi piirin ultraherkkiin vasteelementtiin liittyvän positiivisen palautteen vuoksi. Hystereettinen bistabiili järjestelmä voi toimia luotettavana reversiibelinä kytkimenä, koska järjestelmän on vaikeampi siirtyä "on"- ja "off"-tilojen välillä (verrattuna vastaavaan monostabiiliin yliherkkyyteen). Järjestelmä voidaan myös konfiguroida niin, että yksi siirtymistä ei ole fyysisesti tavoitettavissa; esimerkiksi mikään ärsykkeen vähennys ei palauta järjestelmää "pois"-tilaan, jos se on jo "on"-tilassa. Tämä muodostaa luotettavan peruuttamattoman kytkimen. Yksinkertaisen biologisen kytkimen suunnittelu on kuvattu konferenssipaperissa [10] .
Verkkotopologioiden välillä ei ole henkilökohtaista vastaavuutta, koska monilla verkoilla on samanlaiset sisään- ja ulostulosuhteet. Verkkotopologia ei tarkoita tuloa tai lähtöä, ja vastaavasti tulo tai lähtö ei tarkoita verkkotopologiaa. Tästä syystä parametrointi on erittäin tärkeää piirin toiminnan kannalta. Jos syötteen dynamiikka on verrattavissa järjestelmän reaktioon tai sitä nopeampi, vaste voi vaikuttaa hystereettiseltä.
Alla on kuvattu kolme solusyklikytkintä, jotka tarjoavat äkillisiä ja/tai peruuttamattomia siirtymiä käyttämällä joitain yllä kuvattuja mekanismeja.
G1/S - siirtymä , joka tunnetaan paremmin orastavan hiivan tarkistuspisteenä (rajoituspiste muissa organismeissa), säätelee solusyklin kulkua [1] . Tässä tarkistuspisteessä solut joko pysähtyvät ennen DNA:n replikoitumista (ravinteiden rajoituksen tai feromonisignaalin vuoksi), pidentävät G1:tä (kokokontrolli) tai alkavat replikaation ja käyvät läpi loppuosan solusyklistä. G1/S-säätelyverkosto tai reguloni orastavassa hiivassa sisältää sykliinit G1 Cln1, Cln2 ja Cln3, Cdc28 (Cdk1), transkriptiotekijät SBF ja MBF sekä transkription estäjä Whi5 [2] . Cln3 on vuorovaikutuksessa Cdk1:n kanssa käynnistääkseen tapahtumasarjan fosforyloimalla monenlaisia kohteita, mukaan lukien SBF, MBF ja Whi5 . Whi5 :n fosforylaatio saa sen siirtymään ulos ytimestä, mikä estää SBF:n ja MBF:n estävän sitä. Aktiivinen SBF/MBF ohjaa G1/S-siirtymää, mukaan lukien B-tyypin sykliinit ja käynnistää DNA:n replikaation, silmujen muodostumisen ja karan monistumisen. Lisäksi SBF/MBF säätelee Cln1:n ja Cln2:n ilmentymistä, jotka voivat myös olla vuorovaikutuksessa Cdk1:n kanssa edistääkseen kohteidensa fosforylaatiota.
Tämän G1/S-kytkimen uskottiin alun perin toimivan lineaarisena tapahtumasarjana, joka alkaa Cln3:sta ja päättyy vaiheeseen S [11] . Kuitenkin havainto, että jompikumpi Clns oli riittävä aktivoimaan regulonin, osoittaa, että Cln1 ja Cln2 voivat kyetä käyttämään positiivista palautetta aktivoidakseen oman transkriptionsa. Tämä johtaisi jatkuvasti kiihtyvään sykliin, joka voisi toimia peruuttamattomana bistabiilina flip-flopina [2] . Scotheim ym. käyttivät yksisolumittauksia orastavassa hiivassa osoittaakseen, että tämä positiivinen palaute todellakin tapahtuu [2] . Pieni määrä Cln3:a indusoi Cln1/2:n ilmentymisen, ja sitten tulee peliin takaisinkytkentäsilmukka, joka johtaa Whi5 :n nopeaan ja äkilliseen poistumiseen ytimestä ja sen seurauksena G1/S-regulonigeenien koherentista ilmentymisestä. Koherentin geenin ilmentymisen puuttuessa solujen poistuminen G1:stä kestää kauemmin, ja merkittävä osa jopa pysähtyy ennen S-vaihetta, mikä korostaa positiivisen palautteen merkitystä G1/S-kytkimen tehostamisessa.
G1/S-solusyklin tarkistuspiste ohjaa eukaryoottisolujen siirtymistä G1-aukon ensimmäisestä vaiheesta DNA-synteesivaiheeseen, S. Tässä nisäkässolujen vaihdossa on kaksi solusyklikinaasia, jotka auttavat kontrolloimaan tarkistuspistettä: solusyklinen. kinaasit CDK4/6-sykliini D ja CDK2-sykliini E [1] . Transkriptiokompleksi, joka sisältää Rb:n ja E2F:n, on tärkeä tämän tarkistuspisteen ohjaamiseksi. Ensimmäisessä aukkovaiheessa Rb-HDAC-repressorikompleksi sitoutuu E2F-DP1-transkriptiotekijöihin estäen siten alavirran transkriptiota. Rb:n fosforylaatio CDK4/6:lla ja CDK2:lla hajottaa Rb-repressorikompleksin ja toimii solusyklin vaihtajana. Rb:n fosforylaation jälkeen E2F:n transkriptioaktiivisuuden esto poistetaan. Tämä mahdollistaa S-vaiheen geenien transkription, jotka koodaavat proteiineja, jotka tehostavat G1:n siirtymistä S-vaiheeseen.
Monia erilaisia ärsykkeitä käytetään kontrolloimaan tarkistuspisteitä, mukaan lukien TGFb, DNA-vaurio, kosketuksen esto, replikatiivinen ikääntyminen ja kasvutekijän poistuminen. Ensimmäiset neljä vaikuttavat indusoimalla solusyklin kinaasiestäjien INK4- tai Kip/Cip-perheen jäseniä. TGFb estää Cdc25A:n, solusyklin kinaaseja aktivoivan fosfataasin, transkription ja kasvutekijän poistaminen aktivoi GSK3b:n, joka fosforyloi sykliini D:tä. Tämä johtaa sen nopeaan ubikvitinoitumiseen [12] .
G2 alkaa E2F-välitteisellä sykliini A:n transkriptiolla, joka muodostaa sykliini A-Cdk2 -kompleksin. Mitoosiin siirtymiseksi Cdc25 , proteiinifosfataasi , aktivoi sykliini B - Cdk1 -kompleksin (joka löydettiin ensin MPF- tai M-faasiin vaikuttavana tekijänä; Cdk1 tunnetaan myös nimellä Cdc2 fissiohiivassa ja Cdc28 orastavassa hiivassa) [1 . ] . Kun mitoosi alkaa, tuman vaippa hajoaa, kromosomit tiivistyvät ja tulevat näkyviksi, ja solu valmistautuu jakautumaan. Sykliini B -Cdk1:n aktivaatio johtaa tumakalvon tuhoutumiseen, mikä on tyypillistä mitoosin alkamiselle [1] .
Sykliinin B-Cdk1-kompleksi on osallisena säätelypiirissä, jossa Cdk1 voi fosforyloida ja aktivoida aktivaattorinsa Cdc25:n (positiivinen palaute) sekä fosforyloida ja inaktivoida inaktivaattorinsa Wee1 -kinaasin (kaksois negatiivinen palaute) [1] . Tämä piiri voi toimia bistabiilina flip- flopina [13] , jossa on yksi vakaa tila G2:ssa (Cdk1 ja Cdc25 pois päältä, Wee1 päällä) ja toinen vakaa tila vaiheessa M (Cdk1 ja Cdc25 aktiivisia, Wee1 pois päältä). Itse Wee1 :tä säätelevät kuitenkin muut tekijät, kuten Cdr2 .
Tätä ovat ehdottaneet ja puolustaneet Jin et ai. [14] koesarjassaan ihmisen HeLa-solulinjalla vuonna 1998 osoittivat, että mitoosin käynnistää sykliini B:n tilajärjestely solun sisällä. Kuten tiedetään aiemmista kokeista sekä ihmissoluilla että meritähti munasoluilla, Jin et ai. tiivistää, että sykliini B1 on runsaasti sytoplasmassa mitoosin jakautumattomissa vaiheissa, mutta se tunnistetaan ytimessä kompleksina Cdk1:n kanssa juuri ennen kuin solu siirtyy mitoosiin. Muut kokeet ovat osoittaneet, että solut eivät jakautu, jos sykliini B jää sytoplasmaan. Sykliini B:n spatiaalisen sijainnin vaikutusta solujen jakautumiseen ja syklin säätelyyn tutkiakseen edelleen Jin et ai. merkitty sykliini B:llä ydinpaikannussignaalilla (NLS), joka pitää sykliinin ytimen sisällä. Aluksi tämä sykliini B NLS ei tuottanut odotettua nopeutetun mitoosiin pääsyn vaikutusta. Tämä tulos johtuu alla olevassa kuvassa esitetystä estämisestä. Wee1, sykliini B-Cdk1 -kompleksin estäjä, sijaitsee tumassa ja todennäköisesti fosforyloi sykliini B NLS:ää, mikä tekee siitä kyvyttömän toimimaan tarkoitetulla tavalla. Tämä postulaatti vahvistettiin, kun Jin et ai. käytti Cdc2AF:ää, Cdk1:n fosforyloimatonta mutanttia, ja havaitsi kiihtyneen solunjakautumisen johtuen sykliini B:n tumasta. Siksi sykliini B:n tuman lokalisointi on välttämätöntä, mutta ei riittävää solun jakautumisen laukaisemiseksi.
Solusyklin säätelyä koskevassa tutkimuksessa Jin et ai. manipuloidut solut sykliini B:n lokalisoinnin arvioimiseksi soluissa, joissa on DNA-vaurioita. DNA-vaurion ja eksogeenisen sykliini B:n tuman lokalisoinnin yhdistelmän avulla he pystyivät määrittämään, että solut jakautuisivat jopa DNA-vaurion yhteydessä, jos sykliini B pakotettaisiin ilmentymään tumassa. Tämä osoittaa, että sykliini B:n spatiaalinen sijainti voi toimia mitoosin tarkistuspisteenä. Jos solut eivät normaalisti jakautu, kun niiden geneettinen informaatio on vaurioitunut, vaan siirtyvät mitoosiin, jos endogeenistä sykliini B:tä ekspressoituu tumassa, on todennäköistä, että sykliini B:n siirtyminen sytoplasmaan on mekanismi, joka estää epäkypsän mitoosin pääsyn sisään. Tämän hypoteesin vahvistivat edelleen Jin et ai. DNA-vaurion vuoksi G2:ssa pysyneiden solujen analyysi. Näissä soluissa Jin et ai. havaittiin sykliini B-Cdc2 -kompleksin korkeaa aktiivisuutta sytoplasmassa. Tämä vahvistaa aiemmin mainitun teorian, koska se osoittaa, että Cdc2 voi aktivoida sykliinin ilman välitöntä translokaatiota ytimeen. Lisäksi sykliini B-Cdk1-kompleksien kerääntyminen DNA-vaurion vuoksi jakautumattomien solujen sytoplasmaan tukee teoriaa, jonka mukaan sykliini B:n tuman lokalisaatio käynnistää mitoottisen sisäänpääsyn.
Siten sykliini B:n spatiaalinen lokalisaatio näyttelee roolia mitoosiin pääsemisessä. Sykliini B:n siirtyminen sytoplasmasta tumaan on välttämätöntä solun jakautumiselle, mutta se ei ole riittävää, koska sen estäjät eivät päästä solua mitoosiin ennenaikaisesti. Sykliinin B-Cdk1-kompleksin eston varaamisen lisäksi ennenaikaista solunjakautumista estetään itse sykliini B:n translokaatiolla. Syklini B-Cdk1 -kompleksi pysyy sytoplasmassa DNA-vaurioituneissa soluissa sen sijaan, että se siirtyisi tumaan, mikä estää solua estämään solun pääsyä mitoosiin. Tämän alan tutkijoiden seuraava kysymys on, mikä erityinen mekanismi säätelee tätä translokaatiota.
Santos ym. [15] ehdottivat, että sykliini B:n translokaatiota säätelee positiivinen palautemekanismi, joka on samanlainen kuin se, joka säätelee sykliini B-Cdk1 -kompleksin aktivaatiota. He uskoivat, että positiivinen palautesilmukka sisälsi sykliini B:n fosforylaation ja sen siirtymisen ytimeen. Tämän tutkimisen aloittamiseksi he vahvistivat ensin joitain Jinin et al. kokeet, joissa käytettiin immunofluoresenssia sykliini B:n näyttämiseksi sytoplasmassa ennen jakautumista ja translokaatiota ytimeen mitoosin käynnistämiseksi, mitä he käyttivät verrattuna ydinvaippahäiriöön (NEB). Käyttämällä tumasykliiniä, jota Wee1 tai Myt1 ei voi inaktivoida, Santos ym. havaitsivat, että aktiivinen tumasykliini värvää sytoplasmasta lisää sykliiniä siirtymään tumaan. He vahvistivat tämän havainnon käyttämällä iRap-käsittelyä rapamysiinillä. iRap indusoi leimatun sykliini B:n translokaation sytoplasmasta tumaan. Erityisesti Santos et ai. näki, että leimaamaton sykliini B kulkeutuu sykliini B:n kanssa iRapin vaikutuksen alaisena. Leimaamaton sykliini ei reagoi hoitoon ja liikkuu hoidetusta sykliinistä riippumatta. Tämä vahvistaa positiivisen takaisinkytkentäsilmukan ensimmäisen osan, että sykliini B:n tuman lokalisaatio, joka johtaa mitoottiseen sisäänpääsyyn, edistää sytoplasmisen sykliini B:n lisääntynyttä translokaatiota ytimeen, mikä edelleen helpottaa jäljellä olevan sytoplasmisen sykliini B:n kulkeutumista tumaan jne. .
Santos ym. ehdottavat lisäksi, että sykliini B:n fosforylaatio on toinen positiivisen palautesilmukan komponentti. He huomasivat, että sykliini B tulee luonnollisesti ytimeen ennen NEB:tä. Sitä vastoin mutatoitunut, fosforyloimaton sykliini B tulee tumaan NEB:n aikana. Tämä on yllättävää, koska solusyklille on ominaista siirtää sykliini tumaan ennen NEB:tä solusyklin etenemisen mitoottiseen jakautumiseen. Siten Santos et ai. päätellä, että sykliini B:n fosforylaatio edistää translokaatiota ytimeen. Kuitenkin lisäksi translokaatio ytimeen edistää sykliinin fosforylaatiota. Kirjoittajat huomauttavat, että sykliini B:n fosforylaatio ytimessä on 19 kertaa suotuisampaa kuin sytoplasmassa ytimen pienemmän kokonaistilavuuden vuoksi, mikä saa aikaan suuremman fosforylaationopeuden. Fosforylaatiosta johtuva lisääntynyt translokaatio ja translokaation aiheuttama lisääntynyt fosforylaatio kuvaavat positiivista palautesilmukkaa, joka muistuttaa aiemmin havaittua, joka aktivoi sykliini B-Cdk1 -kompleksin.
Yhteenvetona voidaan todeta, että sykliini B:n nukleaarinen lokalisointi tarvitaan solujen pääsyyn mitoosiin. Sykliinin siirtymistä sytoplasmasta tumaan, mikä varmistaa solun jakautumisen, säätelee positiivinen takaisinkytkentäsilmukka. Aktiivinen sykliini B siirtyy ytimeen ja edistää ytimessä olevien lisäsykliiniyksiköiden aktivoitumista ja liikkumista. Tämä ilmiö vahvistuu, kun tarkastellaan fosforylaatiota. Sykliini B:n fosforylaatio edistää tuman translokaatiota, ja tumassa oleva sykliini B fosforyloituu paljon todennäköisemmin, joten tuman lokalisaatio puolestaan edistää sykliini B:n fosforylaatiota.
Kun solut ovat mitoosissa, sykliini B-Cdk1 aktivoi anafaasia stimuloivan kompleksin (APC), joka puolestaan inaktivoi sykliini B-Cdk1:n hajottamalla sykliini B:tä, mikä lopulta johtaa mitoosista poistumiseen. Cdk1:n bistabiilin vastefunktion ja APC:n negatiivisen palautteen yhdistelmä voi synnyttää niin kutsutun relaksaatiooskillaattorin [3] , jossa on teräviä Cdk1-aktiivisuuden purskeita, jotka laukaisevat stabiileja mitoottisia syklejä. Relaksaatiooskillaattorissa ohjausparametri liikkuu kuitenkin hitaasti suhteessa järjestelmän vastedynamiikkaan, mikä voi olla tarkka esitys mitoottisesta syötteestä, mutta ei välttämättä mitoottisesta ulostulosta.
On välttämätöntä inaktivoida sykliini B-Cdk1 -kompleksi solusyklin mitoottisesta vaiheesta poistumiseksi. Solut voivat sitten palata G1-aukon ensimmäiseen vaiheeseen ja odottaa, kunnes sykli jatkuu uudelleen.
Vuonna 2003 Pomerening et al. antoi vahvaa näyttöä tälle hypoteesille osoittamalla hystereesiä ja bistabiilisuutta Cdk1-aktivaatiossa Xenopus -oosyyttien sytoplasmisissa uutteissa [3] . He osoittivat ensin Cdk1:n ajoittaisen piikkivasteen hajoamattoman sykliini B:n pitoisuuden muutokseen (Cdk1-vasteverkoston irrottamiseksi APC-välitteisestä negatiivisesta palautteestasi). Tällainen vaste vastaa kuitenkin sekä monostabiilia yliherkkää siirtymää että bistabiilia siirtymää. Näiden kahden mahdollisuuden erottamiseksi he mittasivat aktiivisen Cdk1:n vakaan tilan tasoja vasteena muuttuville sykliinitasoille, mutta kahdessa erillisessä kokeessa toinen aloitettiin interfaasiuutteella ja toinen jo mitoosissa olevalla uutteella. Sykliinin välipitoisuuksilla he löysivät kaksi kiinteää aktiivista Cdk1-pitoisuutta. Kumpi kahdesta vakaasta tilasta vallitsi, riippui järjestelmän historiasta, eli aloitettiinko ne interfaasi- vai mitoottisesta uutteesta, joka osoitti tehokkaasti hystereesiä ja bistabiilisuutta.
Samana vuonna Sha ym. [16] päätyivät itsenäisesti samaan johtopäätökseen löytämällä hystereesisilmukan myös käyttämällä Xenopus laevis -munauutteita. Tässä artikkelissa testattiin kolmea Nowak-Tyson- mallin ennustetta sen päättelemiseksi, että hystereesi on "solusyklin siirtymien mitoosiin ja siitä ulos" liikkeellepaneva voima. Nowak-Tyson-mallin ennusteet ovat yhteisiä kaikille satulan pisteen haarautumisille. Satulan kärjen haarautumat ovat erittäin hyödyllisiä epätäydellisissä maailmassa, koska ne auttavat kuvaamaan epätäydellisiä biologisia järjestelmiä. Ensimmäinen ennuste oli, että sykliinin kynnyspitoisuus siirtyäkseen mitoosiin on korkeampi kuin sykliinin kynnyspitoisuus poistuakseen mitoosista, ja tämä vahvistettiin täydentämällä syklisiä munauutteita hajoamattomalla sykliini B:llä ja mittaamalla aktivaatio- ja inaktivaatiokynnys sykloheksimidin (CHX) lisääminen, joka on proteiinisynteesin estäjä [1] . Lisäksi myös toinen Nowak-Tyson-mallin ennuste vahvistui: replikoitumaton deoksiribonukleiinihappo eli DNA lisää mitoosiin pääsemiseksi tarvittavaa sykliinin kynnyspitoisuutta. Tämän johtopäätöksen saavuttamiseksi sytostaattisen tekijän vapauttamiin uutteisiin lisättiin CHX, APH (DNA-polymeraasi-inhibiittori) tai molemmat sekä hajoamaton sykliini B. Kolmas ja viimeinen ennuste, joka testattiin ja vahvistettiin tässä artikkelissa, oli, että Cdc2-aktivaation nopeus hidastuu lähellä sykliiniaktivaation kynnyspitoisuutta. Nämä ennusteet ja kokeet osoittavat kytkentäkäyttäytymistä, joka on samanlainen kuin kytkentä, jota voidaan kuvata hystereesillä dynaamisessa järjestelmässä [17] .
Siirtyessä metafaasista anafaasiin on erittäin tärkeää, että sisarkromatidit erottuvat oikein ja samanaikaisesti solun vastakkaisiin päihin [1] . Sisarkromatidierottelu estetään aluksi voimakkaasti ennenaikaisen erotuksen estämiseksi myöhäisessä mitoosissa, mutta tätä estoa vaimentaa inhiboivien elementtien tuhoaminen anafaasia stimuloivan kompleksin (APC) vaikutuksesta, kun sisarkromatidin biorientaatio on saavutettu. Yksi tällainen inhiboiva elementti on securiini , joka estää kohesiinin , kompleksin, joka pitää sisarkromatideja yhdessä, tuhoamisen sitoutumalla proteaasiseparaasiin , joka kohdistuu Scc1 :een, kohesiinikompleksin alayksikköön tuhoamista varten. Tässä järjestelmässä Cdc14- fosfataasi voi poistaa estävän fosfaatin securiinista, mikä helpottaa APC-securiinin hajoamista vapauttamalla separaasia. Kuten Uhlmann ym. ovat osoittaneet, kromosomien kiinnittymisen aikana mitoottiseen karaan kromatidit pysyvät pareittain, koska sisarusten välinen sidos estää erottamisen [8] [18] . Koheesio muodostuu DNA:n replikaation aikana ja riippuu kohesiinista, joka on monialayksikkökompleksi, joka koostuu Scc1:stä, Scc3:sta, Smc2:sta ja Smc3:sta. Hiivassa metafaasista anafaasiin siirtymisen aikana Scc1 dissosioituu kromosomeista ja sisarkromatidit erottuvat. Tätä toimintaa säätelee Esp1-proteiini, joka on tiukasti sitoutunut anafaasin estäjä Pds1:een, jota anafaasia stimuloiva kompleksi hajottaa. Sen varmistamiseksi, että Esp1 todellakin näyttelee roolia Scc1-kromosomien yhdistymisen säätelyssä, solukannat pysäytettiin G1:ssä alfatekijällä. Nämä solut pysyivät pidätettyinä kehityksen aikana. Mutantteja Esp1-1-soluja käytettiin ja koe toistettiin, jolloin Scc1 sitoutui onnistuneesti kromosomeihin ja pysyi assosioituneena jopa synteesin lopettamisen jälkeen. Tämä oli tärkeää sen osoittamisessa, että Esp1:n kanssa Scc1:n kyky liittyä stabiilisti kromosomeihin G1:n aikana estyy, ja Esp1 voi itse asiassa poistaa Scc1:n kromosomeista suoraan.
Tämän ovat osoittaneet Holt et ai. [4] että separaasi aktivoi Cdc14:n, joka puolestaan vaikuttaa securiiniin, mikä luo positiivisen takaisinkytkentäsilmukan, joka parantaa metafaasista anafaasiin siirtymisen selkeyttä ja sisarkromatidien erotuksen koordinaatiota [19] . Holt ym. tutkivat positiivisen palautevaikutuksen perusteita securiinin fosforylaatioon käyttämällä mutanttisecuriinihiivakantoja ja testasivat, kuinka muutokset securin fosforin säätelyssä vaikuttavat sisarkromatidierotuksen synkronointiin. Heidän tulokset osoittavat, että tämän securin-separase-cdc14-positiivisen silmukan häiriöt vähentävät sisarkromatidierotuksen synkronointia. Tämä positiivinen palaute voisi hypoteettisesti synnyttää bistabiilisuuden siirtyessä anafaasiin, mikä saa solun tekemään peruuttamattoman päätöksen erottaa sisarkromatidit.
Mitoosista poistuminen on tärkeä siirtymäkohta, joka merkitsee mitoosin loppua ja uuden G1-vaiheen alkamista solulle, ja solun on turvauduttava spesifisiin ohjausmekanismeihin, jotta mitoosista poistumisen jälkeen se ei palaa mitoosiin ennen kuin se on saattaa loppuun. Läpäisi vaiheet G1, S ja G2 ja läpäisi kaikki vaaditut tarkistuspisteet. Monet tekijät, mukaan lukien sykliinit , sykliinistä riippuvaiset kinaasit (CDK:t), ubikvitiiniligaasit , sykliinistä riippuvaisten kinaasien estäjät ja palautuva fosforylaatio , säätelevät mitoottista poistumista varmistaakseen, että solusyklin tapahtumat tapahtuvat oikeassa järjestyksessä vähiten virheiden kanssa [20] . Mitoosin päättymiselle on tunnusomaista karan hajoaminen, kinetokorimikrotubulusten lyheneminen ja astraalien (ei- kinetokori ) mikrotubulusten voimakas kasvu [21] . Normaalille eukaryoottisolulle poistuminen mitoosista on peruuttamatonta [22] .
Monia ehdotuksia on tehty koskien kontrollimekanismeja, joita solu käyttää mitoosista poistumisen peruuttamattomuuden varmistamiseksi mallieukaryoottisessa organismissa, orastavassa hiivassa Saccharomyces cerevisiae . Solusyklin säätelijöiden proteolyyttistä hajoamista ja vastaavaa vaikutusta sykliiniriippuvaisten kinaasien tasoihin on ehdotettu mekanismiksi, joka edistää eukaryoottisolusykliä ja erityisesti siirtymistä metafaasista anafaasiin. Tässä teoriassa anafaasia stimuloiva kompleksi (APC), ubikvitiiniligaasiluokka, edistää mitoottisten sykliinien (Clb2) ja anafaasia inhiboivien tekijöiden (PDS1, CUT2) hajoamista edistääkseen mitoottista poistumista [23] . APC ubiquitinoi yhdeksän aminohapon motiivin, joka tunnetaan häiriölaatikona (D-box) mitoottisten sykliinien NH2-terminaalisessa domeenissa proteasomin hajoamista varten [23] . APC yhdessä Cdc20 :n (APC-Cdc20) kanssa ubikvitinoituu ja kohdistuu mitoottisiin sykliineihin (Clb2) hajoamista varten alkuvaiheessa. Samanaikaisesti APC-Cdc20 välittää sekuriinien hajoamista, jotka estävät separaaseja sitoutumalla varhaisessa anafaasissa. Vapautunut ja aktiivinen separaasi pilkkoo kohesiinia, joka pitää sisarkromatidit yhdessä, mikä helpottaa sisarkromatidien erotusta ja käynnistää mitoottisen poistumisen, mikä edistää Cdc14:n vapautumista nukleoluksesta [24] [25] . Myöhemmässä vaiheessa Cdk1:n säätely ja Cdc14:n, Cdh1:tä aktivoivan fosfataasin, aktivoituminen edistää APC:n muodostumista yhdessä Cdh1:n kanssa (APC-Cdh1) hajottamaan Clb2:ta [22] . Cdc20 ja Cdh1, jotka ovat APC-aktivaattoreita, värväävät substraatteja, kuten securiinia ja B-tyypin sykliinejä (Clb) ubikvitinaatioon [26] . Ilman Cdk1-Clb2-komplekseja karan dynamiikkaan osallistuvien proteiinien, kuten Sli15:n, Ase1:n ja Ask1 :n, fosforyloimiseksi , karan venyminen ja kromosomien segregaatio varmistetaan, mikä helpottaa mitoosista poistumista [22] . Proteolyyttisen hajoamisen merkitys eukaryoottisolusyklissä on muuttanut näkemyksen solujen jakautumisesta yksinkertaisena kinaasikaskadina monimutkaisemmaksi prosessiksi, joka vaatii vuorovaikutusta fosforylaation, ubikvitinaation ja proteolyysin välillä [23] . Kokeet, joissa käytettiin orastuvia hiivasoluja, joissa on cdc28-as1, INM-PP1 (ATP-analogi) -herkkä Cdk-alleeli, ovat kuitenkin osoittaneet, että B-tyypin sykliinien (Clb) tuhoaminen ei ole välttämätöntä peruuttamattoman mitoosista poistumisen laukaisemiseksi [22] . Clb2:n hajoaminen lyhentää Cdk1:n eston ajanjaksoa, joka vaaditaan peruuttamattoman mitoottisen poistumisen laukaisemiseksi, mikä osoittaa, että sykliiniproteolyysi myötävaikuttaa eukaryoottisen solusyklin dynaamiseen luonteeseen sen hitaamman vaikutusajan vuoksi, mutta se ei todennäköisesti ole pääasiallinen tekijä peruuttamattoman prosessin laukaisemisessa. solukierto.. siirtymät [22] .
On tehty löytöjä, jotka osoittavat sykliinistä riippuvaisten kinaasien estäjien tason tärkeyden eukaryoottisolusyklin säätelyssä. Erityisesti on osoitettu, että Sic1 :n, Clb-CDK-kompleksien stoikiometrisen inhibiittorin orastavassa hiivassa, taso on erityisen tärkeä irreversiibelille G1-S-siirtymiselle johtuen S-faasikinaasien palautumattomasta aktivaatiosta [27] . On osoitettu, että Sic1-tasolla on tärkeä rooli peruuttamattoman poistumisen laukaisemisessa mitoosista (M-G1-siirtymä) sekä G1-S-siirtymässä. Mitoosin aikana Cdk1-tasojen lasku johtaa Cdc14:n, fosfataasin, joka vastustaa Cdk1:n aktivaatiota aktivoimalla Cdh1:tä ja Swi5:tä, jotka ovat Sic1-proteiinien transkription aktivaattori [28] . Vaikka Sic1:n hajoaminen tietylle alhaiselle tasolle laukaisi S-vaiheen, Sic1:n kertymistä tietylle korkealle tasolle vaadittiin peruuttamattoman mitoosista poistumisen laukaisemiseksi [22] . Cdk1-inhibiittorit voivat indusoida mitoottista poistumista jopa silloin, kun B-tyypin sykliinien hajoaminen on estetty hajoamattomien Clbs- tai proteasomi-inhibiittorien ilmentymisellä. Sisarkromatidit eivät kuitenkaan erotu ja solut palaavat mitoosiin sen jälkeen, kun inhibiittorit on huuhtoutunut pois, mikä osoittaa, että inhibiittoreiden kynnystaso on saavutettava peruuttamattoman mitoottisen poistumisen laukaisemiseksi sykliinin hajoamisesta riippumatta [29] . Huolimatta erilaisista Sic1-tason kynnyksistä, jotka vaaditaan mitoottisen poistumisen laukaisemiseksi G1-S-siirtymään verrattuna, Sic1-tasolla on osoitettu olevan avainrooli eukaryoottisen solusyklin säätelyssä estämällä CDK-aktiivisuutta.
Koska eukaryoottinen solusykli sisältää monia proteiineja ja säätelyvuorovaikutuksia, dynaamisten järjestelmien lähestymistapaa voidaan käyttää monimutkaisen biologisen ketjun yksinkertaistamiseksi yhteiseksi rakenteeksi paremman analyysin saavuttamiseksi [30] . Neljän mahdollisen syöttö/tulostussuhteen joukossa Sic1-tason ja mitoottisen poistumisen välinen suhde näyttää osoittavan peruuttamattoman bistabiilin kytkimen ominaisuuksia, joita ohjaa APC-Cdh1:n, Sic1:n ja Clb2-Cdk1:n välinen takaisinkytkentä [22] . Bstabiilisuuden tiedetään säätelevän biologisia toimintoja, kuten solusyklin säätelyä ja solujen erilaistumista, ja sillä on keskeinen rooli monissa solujen säätelyverkostoissa [31] . Bistabiilille tulo/lähtöliitännälle on tunnusomaista kaksi vakaata tilaa, joissa on kaksi haarautumispistettä. Useita uloskäyntiä on mahdollista yhdelle tietylle sisäänkäynnille kahdella haaroittumispisteellä merkityllä bistabiilisuuden alueella. Lisäksi bistabiilissa kytkennässä on hystereesi: lopullinen tila/lähtö riippuu tulon historiasta sekä tulon nykyisestä arvosta, koska järjestelmässä on muisti [32] . Yhdellä bifurkaatiopisteellä on negatiivinen ohjausparametrin arvo (haaroituspiste on akselin toisella puolella), mikä johtaa kahden vakaan tilan väliseen aukkoon ja tilasta toiseen siirtymisen peruuttamattomuuteen. Mitä tulee mitoosista poistumiseen, mitoosin ja G1-vaiheen määräävät kaksi stabiilia tilaa. Kun Sic1 (syöte) taso ylittää kynnyksen, tapahtuu peruuttamaton siirtyminen mitoosista (stabiili tila I) G1-vaiheeseen (stabiili tila II). Epätäydellisessä ympäristössä ainoa haaroittuminen, joka pysyy muuttumattomana, on satula-solmun haarautuminen . Satula-solmun bifurkaatiota ei rikota (satula-solmu on odotettu yleinen käyttäytyminen), kun taas transkriittiset ja haarukkahaarat eivät riko epätäydellisyyksiä [33] . Siten ainoa yksiulotteinen bifurkaatio, joka voi esiintyä epätäydellisessä biologisessa maailmassa, on satula-solmuhaarautuminen [32] . M-G1-siirtymän ja Sic1-tason välinen bistabiili yhteys voidaan esittää kaaviona kahdesta satula-solmuhaaroituksesta, jossa järjestelmän käyttäytyminen muuttuu kvalitatiivisesti pienellä muutoksella ohjausparametrissa, Sic1:n arvossa.
Koska solusyklin käyttäytyminen on kriittisesti riippuvainen Sic1:n määrästä M-G1-siirtymätilassa, Sic1:n määrää säätelee tiukasti takaisinkytkentä järjestelmätasolla. Koska Cdk1-Clb2 estää Sic1:tä fosforyloimalla Sic1:n ja tekemällä Sic1:n saataville hajoamista varten ubikvitinaation kautta, Cdk1-Clb2:n APC-Cdh1-riippuvainen hajoaminen ei ainoastaan vähennä saatavilla olevien Cdk1-Clb2-kompleksien määrää, vaan lisää myös Sic1:n tasoa. kääntää entisestään estää Cdk1-Clb2:n toimintaa [28] . Tämä kaksinkertainen negatiivinen takaisinkytkentäsilmukan aktivaatio käynnistyy APC-Cdc20-riippuvaisen Cdk1-Clb2:n hajoamisen ja Cdc14:n vapautumisen seurauksena nukleolaarisesta Net1/Cfi1-proteiinista [34] . FEAR (anaphase early release of Cdc14) -reitti helpottaa Clb2-Cdk1-riippuvaista Net1-fosforylaatiota, joka vapauttaa väliaikaisesti Cdc14:ää Net1:stä [35] . Vapautuneet Cdc14- ja Clb2-Cdk1-kompleksit siirtyvät karaan, mikä aktivoi mitoosin poistumisverkoston (MEN). MEN varmistaa Cdc14:n jatkuvan vapautumisen tumasta [35] ja Cdc14 vastustaa Clb2-Cdk1-aktiivisuutta aktivoimalla Cdh1:n ja stabiloimalla Sic1:tä aktivoimalla Sic1-transkription aktivaattorin Swi5 [36] . Sic1 säätelee itseään positiivisesti estämällä Cdk1-Clb2:n vapauttamaan Swi5-inhibitiota, ja Cdh1 säätelee myös itseään positiivisesti estämällä Clb2-Cdk1:n vapauttamaan MEN-inhibitiota, joka voi aktivoida Cdc14:n ja sitten itse Cdh1:n. APC-Cdh1:n ja Sic1:n muodostama kaksinkertainen negatiivinen takaisinkytkentäsilmukka on välttämätön alhaisen Clb2-Cdk1-aktiivisuuden ylläpitämiseksi, koska Clb2 aktivoi automaattisesti synteesinsä aktivoimalla transkriptiotekijöitä, Fkh2-Mcm1 Ndd1 -kompleksia [28] .
Eukaryoottinen solusykli koostuu erilaisista tarkistuspisteistä ja palautesilmukoista oikean ja onnistuneen solunjakautumisen varmistamiseksi. Esimerkiksi mitoosin aikana, kun kaksinkertaiset kromosomit ovat kiinnittyneet väärin mitoottiseen karaan, karan kokoonpanon tarkistuspisteen (SAC) proteiinit, mukaan lukien Mad ja Bub, estävät APC-Cdc20:n, viivästyttäen pääsyä anafaasiin ja B-tyypin sykliinin hajoamista. Lisäksi kun mitoottiset karat siirtyvät, Bub2 ja Bfa1 inhiboivat MEN:ää ja myöhemmin Cdc14:ää mitoottisten sykliinien hajoamisen ja anafaasiin pääsyn estämiseksi [36] . Sic1 on hyvä esimerkki siitä, kuinka järjestelmätason takaisinkytkentäsilmukat havaitsevat ympäristöolosuhteet ja laukaisevat solusyklin siirtymiä. Vaikka varsinainen M-G1-siirtymä on äärimmäisen monimutkainen, ja siihen liittyy monia proteiineja ja säännöksiä, dynaamisten järjestelmien lähestymistapa mahdollistaa tämän monimutkaisen järjestelmän yksinkertaistamisen bistabiiliksi tulo/lähtösuhteeksi kahdella satulasolmuhaaroituksella, jossa lähtö (mitoottinen lähtö) riippuu kriittinen keskittyminen. Sic1. Yksimuuttuja-analyysiä käyttämällä voitaisiin selittää monet peruuttamattomat siirtymäkohdat eukaryoottisolusyklissä, joita säätelee ohjaus ja palaute järjestelmätasolla. Muita esimerkkejä peruuttamattomista siirtymäpisteistä ovat Start (peruuttamaton sitoutuminen uuteen solunjakautumisen sykliin), joka voidaan selittää peruuttamattomalla bistabiililla kytkimellä, jonka ohjausparametria säätelevät tiukasti järjestelmäpalautteet, mukaan lukien Cln2, Whi5 ja SBF [ 37] .
| solusykli | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Vaiheet |
| ||||||||||
| Sääntelyviranomaiset |
| ||||||||||