Kohdennettu mutageneesi

Kohdennettu mutageneesi ( paikkaohjattu mutageneesi tai oligonukleotidisuuntautunut mutageneesi ) on  molekyylibiologian tekniikka, jota käytetään luomaan spesifisiä ja tarkoituksellisia muutoksia DNA-sekvenssiin , geeniin ja geenituotteisiin. Käytetään DNA:n, RNA :n ja proteiinien rakenteen ja biologisen aktiivisuuden tutkimiseen sekä proteiinien suunnitteluun .

Kohdennettu mutageneesi on yksi tärkeimmistä laboratoriomenetelmistä mutaatioiden tuomiseksi DNA-sekvenssiin. On olemassa lukuisia tapoja saavuttaa kohdennettu mutageneesi, mutta oligonukleotidisynteesin kustannusten laskun vuoksi keinotekoista geenisynteesiä käytetään nykyään joskus vaihtoehtona kohdennetulle mutageneesille. Vuodesta 2013 lähtien prokaryoottiseen antiviraaliseen järjestelmään perustuvan CRISPR / Cas9-teknologian kehitys on mahdollistanut genomin muokkaamisen , ja mutageneesi voidaan suorittaa suhteellisen helposti in vivo [1] .

Historia

Varhaiset mutageneesiyritykset käyttämällä säteilyä tai kemiallisia mutageeneja olivat ei-kohtaspesifisiä ja johtivat satunnaisiin mutaatioihin. Myöhemmin nukleotidianalogeja ja muita kemikaaleja käytettiin luomaan paikallisia pistemutaatioita, kuten aminopuriinia , nitrosoguanidiinia ja bisulfiittia . Kohdennettua mutageneesiä käytettiin ensimmäisen kerran vuonna 1974 Charles Weissmanin laboratoriossa. Käytettiin nukleotidianalogia N-4-hydroksisytidiiniä, joka indusoi siirtymisen GC:stä AT:hen. Nämä mutageneesimenetelmät rajoittuivat kuitenkin mutaation tyyppiin eivätkä olleet yhtä spesifisiä kuin myöhemmät kohdennetut mutageneesimenetelmät.

Vuonna 1971 Clyde Hutchison ja Marshall Edgell osoittivat, että oli mahdollista tuottaa mutantteja, joissa oli pieniä φX174- faagin fragmentteja ja restriktionukleaaseja. Hutchinson kehitti myöhemmin joustavamman kohdennetun mutageneesilähestymistavan käyttämällä oligonukleotideja DNA-polymeraasin laajennusmenetelmässä yhteistyössä hänen Michael Smithin kanssa vuonna 1978 . Michael Smith jakoi myöhemmin kemian Nobelin palkinnon lokakuussa 1993 Kary Mullisin kanssa , joka keksi polymeraasiketjureaktion .

Perusmenettely edellyttää lyhyen DNA- alukkeen synteesiä . Tämä synteettinen aluke sisältää halutun mutaation ja on komplementaarinen tulevan mutaation kohdan ympärillä olevalle templaatti-DNA:lle, jotta se voi hybridisoitua genomin DNA:han. Mutaatio voi olla yhden emäksen muutos ( pistemutaatio ), usean emäksen muutos, deleetio tai insertio . Yksijuosteinen aluke pidennetään sitten käyttämällä DNA-polymeraasia, joka kopioi loput geenistä. Siten replikoitunut geeni sisältää mutanttikohdan ja viedään sitten isäntäsoluun vektorina ja kloonataan. Lopuksi mutantit valitaan DNA-sekvensoinnilla sen varmistamiseksi, että ne sisältävät halutun mutaation.

Alkuperäinen menetelmä, jossa käytettiin yhden alukkeen pidennystä, oli tehoton alhaisen mutanttien saannon vuoksi. Tuloksena oleva seos sisältää sekä alkuperäisen mutatoimattoman näytteen ( villityyppi ) että mutatoidun DNA-juosteen, muodostaen siten mutanttien ja ei-mutanttien sekapopulaation. Lisäksi käytetty villityyppi on metyloidussa muodossa, kun taas mutantissa juoste on metyloitumaton ja mutantteja voidaan rajoittaa modifikaatio-restriktiojärjestelmän yhteensopimattomuuden vuoksi, mikä johtaa vähemmän mutantteja. Siksi myöhemmin kehitettiin menetelmiä mutageneesin tehokkuuden parantamiseksi.

Menetelmät

Kohdennettuun mutageneesiin on saatavilla suuri määrä menetelmiä, vaikka useimpia niistä on nykyään käytetty harvoin laboratorioissa 2000-luvun alusta lähtien, koska uudet modernit tekniikat tarjoavat helpompia tapoja viedä mutaatio tiettyyn kohtaan geenissä.

Kunkelin menetelmä

Vuonna 1985 Thomas Kunkel käytti menetelmää, joka helpottaa mutanttien valintaa. Mutatoitava DNA-fragmentti insertoidaan faasimideihin , kuten M13mp18/19, ja transformoidaan sitten E. coli -kantaan, josta puuttuu kaksi entsyymiä, dUTPaasi (UI) ja urasiilideglykosylaasi (UDG). Molemmat entsyymit ovat osa DNA:n korjausjärjestelmää, joka suojaa bakteerikromosomia spontaaneilta deaminaatiomutaatioilta dCTP :stä dUTP:ksi. dUTPaasin puute estää dUTP:n tuhoutumisen, mikä johtaa korkeaan dUTP-tasoon solussa. Ursiilideglykosylaasin puute estää urasiilin poistumisen vasta syntetisoidusta DNA:sta. Kun faagi-DNA replikoituu E. coli -kaksoismutantissa , sen entsymaattinen järjestelmä voi siten liittää väärin dUTP:n dTTP:n sijasta, mikä johtaa yksijuosteiseen DNA:han, joka sisältää useita urasiileja (ssU-DNA). SsU-DNA uutetaan sitten bakteriofagista, joka vapautetaan väliaineeseen ja käytetään sitten templaattina mutageneesissä. Oligonukleotidia, joka sisältää halutun mutaation, käytetään alukkeen pidentämiseen. Tuloksena oleva DNA-heterodupleksi koostuu yhdestä ei-mutantista lähtöjuosteesta, joka sisältää dUTP:n, ja mutanttijuosteesta, joka sisältää dTTP:n. DNA transformoidaan sitten E. coli -kantaan, joka sisältää villityypin IU- ja UDG-geenit. Sen jälkeen urasiilia sisältävä emo-DNA-juoste hajoaa niin, että lähes kaikki tuloksena oleva DNA koostuu mutatoidusta juosteesta.

Kasettimutageneesi

Toisin kuin muut menetelmät, kasettimutageneesi ei välttämättä sisällä alukkeen pidentämistä käyttämällä DNA-polymeraasia. Tässä menetelmässä DNA-fragmentti syntetisoidaan ja insertoidaan sitten plasmidiin. Se sisältää pilkkomisen restriktioentsyymillä plasmidin kohdassa ja sen jälkeen komplementaarisen oligonukleotidiparin ligaation, joka pari sisältää mutaation kiinnostavassa geenissä plasmidissa. Tyypillisesti restriktioentsyymit, jotka leikkaavat plasmidin ja oligonukleotidin, ovat samat, mikä antaa plasmidille tahmeat päät ja insertit ligatoitumaan toisiinsa. Tämä menetelmä voi tuottaa mutantteja, jotka ovat lähes 100-prosenttisesti tehokkaita, mutta sitä rajoittaa sopivien restriktiokohtien läsnäolo mutatoitavan kohdan vieressä.

PCR-paikkaohjattu mutageneesi

Rajoitettu määrä restriktiokohtia kasettimutageneesissä voidaan voittaa polymeraasiketjureaktiolla oligonukleotidi"alukkeiden" kanssa siten, että voidaan muodostaa suurempi fragmentti, joka kattaa kaksi sopivaa restriktiokohtaa. Eksponentiaalinen PCR-amplifikaatio tuottaa fragmentin, joka sisältää halutun mutaation riittävässä määrin, jotta se voidaan erottaa alkuperäisestä, mutoimattomasta plasmidista geelielektroforeesilla, joka voidaan sitten liittää alkuperäiseen kontekstiin käyttämällä tavanomaisia ​​rekombinanttimolekyylibiologian tekniikoita. Tästä menetelmästä on monia muunnelmia. Yksinkertaisin menetelmä sijoittaa mutaatiokohdan fragmentin toiseen päähän, jolloin tuloksena on toinen kahdesta oligonukleotidistä, joita käytetään mutaation sisältävän fragmentin muodostamiseen. Tämä menetelmä sisältää yhden PCR-vaiheen, mutta siinä on silti ongelma, joka vaatii sopivan restriktiokohdan lähellä mutaatiokohtaa, ellei käytetä hyvin pitkää aluketta. Muut variantit käyttävät siksi kolmea tai neljää oligonukleotidiä, joista kaksi voi olla ei-mutageenista oligonukleotidia, jotka kattavat kaksi restriktiokohtaa ja tuottavat fragmentin, joka voidaan rajoittaa ja ligatoida plasmidiin, kun taas mutageeninen oligonukleotidi voi olla komplementaarinen tämän fragmentin sisällä olevan kohdan kanssa. mistä tahansa sopivasta rajoitussivustosta. Nämä menetelmät vaativat useita PCR-vaiheita, jotta lopullinen ligoitava fragmentti voi sisältää halutun mutaation. Suunnitteluprosessi sellaisen fragmentin tuottamiseksi, jossa on haluttu mutaatio ja sopivat restriktiokohdat, voi olla hankala. Ohjelmat, kuten SDM-Assist, voivat yksinkertaistaa tätä prosessia.

Koko plasmidimutageneesi

Plasmidimanipulaatiota varten muut kohdennetut mutageneesitekniikat on korvattu menetelmillä, jotka ovat erittäin tehokkaita, mutta suhteellisen yksinkertaisia ​​ja helppokäyttöisiä ja jotka ovat myös kaupallisesti saatavilla pakkauksena. Esimerkki näistä menetelmistä on QuikChange-menetelmä, jossa komplementaaristen mutageenisten alukkeiden paria käytetään monistamaan koko plasmidi lämpösyklireaktiossa käyttämällä erittäin tarkkaa, ei-juostetta syrjäyttävää DNA-polymeraasia, kuten pfu -polymeraasia . Reaktio tuottaa lovettua, pyöreää DNA:ta. Templaatti-DNA on eliminoitava entsymaattisella pilkkomalla restriktioentsyymillä, kuten DpnI :llä , joka on spesifinen metyloidulle DNA :lle . Kaikki useimmista E. coli -kannoista saatu DNA metyloidaan; Näyteplasmidi, joka syntetisoidaan E. colissa, on siten rajoitettu, kun taas mutatoitunut plasmidi, joka on tuotettu in vitro, on metyloitumaton ja pysyy rajoittamattomana. On huomattava, että näissä kaksijuosteisissa plasmidimutageneesimenetelmissä, vaikka lämpösyklireaktiota voidaan käyttää, ei ole tarvetta DNA:n monistamiselle PCR:ssä. Sen sijaan monistus on lineaarinen, eikä sitä siksi voida sanoa PCR:ksi, koska siihen ei liity ketjureaktiota.

On huomattava, että pfu -polymeraasi voi muuttua ketjua syrjäyttäväksi korkeammassa venymislämpötilassa (≥70 °C), mikä voi johtaa kokeen epäonnistumiseen, joten ejlognaatioreaktio tulisi suorittaa suositellussa lämpötilassa 68 °C. Joissakin sovelluksissa tämä menetelmä johtaa useiden alukkeiden kopioiden lisäämiseen. Tämän menetelmän muunnelma, nimeltään SPRINP, estää tämän artefaktin, ja sitä on käytetty erilaisissa kohdennetun mutageneesin tyypeissä.

Kohdennettu mutageneesi in vivo

CRISPR

Vuodesta 2013 lähtien CRISPR/Cas9-teknologian kehitys on mahdollistanut pistemutaatioiden tehokkaan tuomisen monien eri organismien genomiin. Menetelmä ei vaadi transposonikohdan lisäämistä , ei jätä merkkiä, ja sen tehokkuus ja yksinkertaisuus ovat tehneet siitä suositellun menetelmän genomin muokkaamiseen.

Sovellus

Kohdennettua mutageneesiä käytetään luomaan mutaatioita, jotka voivat tuottaa rationaalisesti suunniteltua proteiinia, jolla on parannettuja tai erityisiä ominaisuuksia (proteiinimuokkaus).

Tutkimustyökalut  - DNA:n erityiset mutaatiot, joiden avulla voit tutkia DNA- tai proteiinisekvenssin toimintoja ja ominaisuuksia rationaalisesti. Lisäksi yksittäisten aminohappojen muutokset proteiineissa kohdistetulla mutageneesillä voivat auttaa ymmärtämään translaation jälkeisten modifikaatioiden tärkeyden. Esimerkiksi tietyn seriinin (fosfo-akseptorin) muuttaminen alaniiniksi (fosfo-ei-akseptori) proteiinisubstraatissa estää kiinnittyneen fosfaattiryhmän, mikä mahdollistaa fosforylaation tutkimisen. Tätä lähestymistapaa on käytetty paljastamaan CBP -proteiinin fosforylaatio HIPK2 -kinaasin toimesta .

Kaupalliset sovellukset  - Proteiinit voidaan suunnitella tuottamaan tiettyyn käyttötarkoitukseen räätälöityjä mutanttimuotoja. Esimerkiksi yleisesti käytetyt pyykinpesuaineet voivat sisältää subtilisiinia , jossa on villityypin metioniinia , joka voidaan hapettaa valkaisuaineella, mikä vähentää suuresti proteiiniaktiivisuutta prosessissa. Tämä metioniini voidaan korvata alaniinilla tai muilla jäännöksillä, jolloin se kestää hapettumista, mikä pitää proteiinin aktiivisena valkaisuaineen läsnä ollessa.

Geenisynteesi

Koska DNA-oligonukleotidien syntetisoinnin kustannukset laskevat, keinotekoinen kokogeenisynteesi on tällä hetkellä käyttökelpoinen menetelmä mutaation tuomiseksi geeniin. Tämä menetelmä mahdollistaa monien kohtien laajan mutageneesin, mukaan lukien geenin kodonin käytön täydellisen uudelleensuunnittelun sen optimoimiseksi tietylle organismille.

Katso myös

Muistiinpanot

  1. ↑ Hsu PD, Lander ES, Zhang F (kesäkuu 2014). "CRISPR-Cas9:n kehitys ja sovellukset genomisuunnitteluun" . solu . 157 (6): 1262-78. DOI : 10.1016/j.cell.2014.05.010 . PMC  4343198 . PMID24906146  . _

Linkit

  Siirry Wikidata-kohteeseen  Sanakirjat ja tietosanakirjat