Nukleosomien paikannus on nukleosomien sijainnin määrittäminen eukaryoottisissa DNA -sekvensseissä. DNA-segmentit voivat olla joko osa nukleosomaalisia komplekseja tai osa linkkeriä, nukleosomaalista DNA:ta. Tämä DNA:n ominaisuus määrää sen saatavuuden vuorovaikutukseen proteiinien kanssa .
Nukleosomien paikantamismenetelmien kehitys juontaa juurensa vuoteen 1973, jolloin ydinkromatiinin ominaisuuden osoitettiin jakautuvan endogeenisten nukleaasien vaikutuksesta sarjaksi yksittäisiä, suunnilleen yhtä pitkiä DNA-fragmentteja. Aluksi kokeissa käytettiin deoksiribonukleaasi I :tä nukleaasina, myöhemmin mikrokokkinukleaasi levisi laajalle [1] .
Kokeellinen menetelmä nukleosomeja muodostavien DNA-alueiden määrittämiseksi perustuu mikrokokkinukleaasin käyttöön ( MNase-seq-menetelmä). Solut jäädytetään ja murskataan, annetaan sulaa. Sulatuksen jälkeen kromatiinia sisältävä homogenaatti käsitellään mikrokokkinukleaasilla. Nukleaasi pilkkoo DNA:n linkkerialueet, joita nukleosomit eivät suojaa. Proteaasien ja RNaasien avulla liuos puhdistetaan proteiineista ja RNA :sta . DNA uutetaan liuoksesta. Sitä käytetään sekä pylväskromatografiassa että nesteuuttovaihtoehdoissa - fenoli-kloroformiuutto [2] .
DNA saostetaan etanolilla . Nukleaasi ei voinut katkaista kaikkia linkkerikohtia. Tässä vaiheessa DNA-tuote koostuu DNA-fragmenttien seoksesta, jotka vastaavat alueita, joilla on erilainen nukleosomipeitto. DNA - fragmentit erotetaan koon mukaan agaroosigeelielektroforeesilla . DNA uutetaan geeliliuskasta, joka sisältää mononukleosomituotteen. Tuloksena saadut DNA - fragmentit valmistetaan sekvensointia varten . Erittäin tehokkaan SOLiD - teknologian käyttö on yleistä . Sekvensoinnin tuloksena saadaan DNA-fragmenttien kirjasto . Fragmentit kartoitetaan genomiin . Genomin eri osien peittoa käytetään arvioimaan nukleosomien sijaintia DNA-sekvenssin mukaan [3] [4] .
Mikrokokkinukleaasin käyttö johtuu siitä, että sillä on sekä endonukleaasi- että eksonukleaasiaktiivisuutta . Nukleaasi leikkaa DNA:n ja katkaisee peräkkäin nukleotidit vapaista päistä. Mikrokokkinukleaasin haittapuolena on se, että se suosii endonukleaasina kohtia, jotka koostuvat vuorottelevista nukleotideista dA ja dT dC : n tai dG :n jälkeen . Samalla se tunnistaa huonosti kohdat vain toistuvista dA:sta tai dT:stä (4–6). Eksonukleaasina mikrokokkinukleaasi pilkkoo nukleotideja dC ja dG hitaammin. Entsyymin työ estyy voimakkaasti DNA:n alueilla, jotka ovat vuorovaikutuksessa proteiinien kanssa. Pitkällä altistusajalla nukleaasi alkaa pilkkoa myös nukleosomaalista DNA:ta, pääasiassa paikoista, jotka ovat lähellä nukleosomin pintaa. Entsyymin työ kokeessa pysäytetään lisäämällä EDTA -liuosta [5] .
MNase-seq-menetelmää voidaan täydentää ultraäänihajotuksella ja/tai histoni-H3-immunosaostuksella (ChIP-seq) sekä käyttämällä entsyymejä, kuten DNaasi (DNase-seq), transposaasi (ATAC-seq) ja CpG [ -metyylitransferaasi (NOME-seq). DNA:n suoraa kemiallista tuhoamista nukleosomien välillä voidaan käyttää esimerkiksi käyttämällä hydroksyyliradikaalia tai pieniä aromaattisia molekyylejä, kuten metidiumpropyyli-EDTA, joka viedään DNA:n kaksoiskierteeseen pääasiassa nukleosomien välisille alueille ja tuhoaa sen Fe 2+ -kationien läsnäolo (MRE-menetelmä -seq) [6] .
Tutkittaessa erilaisia tekijöitä, jotka vaikuttavat nukleosomien jakautumiseen DNA:ssa, yleensä yritetään eristää itse nukleotidisekvenssin vaikutuskomponentti. Tätä varten DNA-kompleksi histoniproteiinien kanssa kootaan in vitro DNA:sta ja histonioktameereistä , jotka on aiemmin puhdistettu proteiineista . DNA:n ja histonien määrät otetaan tietyssä suhteessa, noin yksi histonioktameeri 850 emäsparia kohti . Seuraavaksi suoritetaan samat manipulaatiot kuin tavallisessa menetelmässä käyttäen mikrokokkinukleaasia [3] .
Tällä hetkellä kehitetään menetelmiä nukleosomien paikantamiseen bioinformatiikan menetelmillä . Menetelmien perustana ovat kokeellisesti havaitut säännöllisyydet nukleosomien jakautumisessa genomin eri alueilla ja näiden jakautumien riippuvuus DNA-nukleotidisekvenssistä [7] . Tiedot nukleosomien kokeellisen kartoituksen tuloksista kerätään NPRD- tietokantaan ( Eng. Nucleosome Positioning Region Database ) [8] .