Mad2 (mitoottisen puutteen estäjä 2) on tärkeä karan tarkistuspisteproteiini . Karan tarkistuspistejärjestelmä on säätelyjärjestelmä , joka estää siirtymisen metafaasista anafaasiin . Mad2 -geeni tunnistettiin ensin S. cerevisiae -hiivasta geenien seulonnassa, joka oli mutatoitu tekemään niistä herkkiä mikrotubulusten myrkkyille [1] . Mad2:n ihmisen ortologit ( MAD2L1 ja MAD2L2 eristettiin ensin etsittäessä ihmisen cDNA :ita , jotka pelastavat mikrotubuluksia myrkytysherkkä hiivakanta, josta puuttui kinetokooria sitova proteiini [2] . Proteiinin on osoitettu olevan läsnä yksinäisissä kinetokoreissa, ja vasta-aineiden estotutkimukset ovat osoittaneet sen olevan välttämätön estämään metafaasista anafaasiin siirtymistä vasteena mikrotubulusmyrkytykselle nokodatsolilla [2] . Ihmisen sekvenssien kaltaisen Xenopus Laevis -ortologin eristämisen myötä tuli mahdolliseksi karakterisoida mitoottinen tarkistuspiste munauutteissa [3] .
Etenemistä metafaasista anafaasiin leimaa sisarkromatidien erottuminen . Solusyklin seurantamekanismia, joka estää sisarkromatideja eroamasta ja siirtymästä anafaasiin, kutsutaan karan tarkistuspisteeksi. Kromosomivirheiden estämiseksi karan kokoonpanon tarkistuspiste (SAC) viivästyttää anafaasia, kunnes kaikki sisarkromatidiparit on kiinnitetty bipolaariseen suuntaan.
Kun mikrotubulukset on kiinnitetty kinetokoreihin , kromosomit asettuvat metafaasilevylle ja biorientaatio saavutetaan, SAC-pysäytysmekanismi poistetaan. APCCdc20:n aktivaatio välittää pääsyn anafaasiin. APCCdc20 on ubikvitiiniproteiiniligaasi, joka leimaa proteiinin, securiinin, tuhottavaksi. Securinin tuhoaminen vapauttaa ja aktivoi separasea. Securiiniin sitoutunut separase pysyy estettynä; kuitenkin, kun esto vapautetaan, aktivoitunut separaasi pilkkoo kohesiinikompleksin, joka sitoo sisarkromatidit yhteen [5] .
Ilman Cdc20: tä anafaasistimulaatiokompleksi (APC) ei voi aktivoitua eikä anafaasia tapahdu. Mad2:n on osoitettu estävän APC-aktiivisuutta suoralla fysikaalisella vuorovaikutuksella [6] kolmikomponentissa Cdc20:n kanssa [7] . Kinetokorit, joihin mikrotubulukset pysyvät kiinnittyneinä, katalysoivat Mad2:n Cdc20:n sekvestraatiota. Itse asiassa, kun nisäkässoluja käsitellään karan depolymerointiaineella nokodatsolilla metafaasissa , MAD2-proteiinit lokalisoituvat kinetokooreihin kaikkien sisarkromatidiparien avulla [5] .
Mad2 pystyy muodostamaan multimeerejä ja omaksuu vähintään kaksi rakenteellista konformaatiota . Open Mad2 eroaa suljetusta Mad2:sta C-terminaalisen -segmentin 50 tähteen sijoittelussa. Tämä "turvavyö" puristettiin tiukasti proteiinin oikeaa puolta vasten avoimessa konformaatiossa. Kun turvavyö on löysätty, sitoja voi asentaa sen takaisin. Suljetussa konformaatiossa valjaat kietoutuvat sitoutuneen ligandin ympärille ja ovat vuorovaikutuksessa toisen Mad2-alueen kanssa. Mad2-sidospartnerit voivat olla joko Cdc20 tai Mad1. Mad1 ja Cdc20 sitovat Mad2:n samalla tavalla. Mad2 käyttää samaa kohtaa joko Mad1:n tai Cdc20 :n sitomiseen ja voi siten sitoa vain toista kahdesta proteiinista kerrallaan [5] .
Koska yksinäiset kinetokoorit muodostavat ja ylläpitävät SAC:tä, Mad2 värvätään estämään näitä häiriintyneitä sisarkromatideja eroamasta . Kun tarkistuspisteen estoprosessi aktivoituu, Mad2 sitoo Mad1:n muodostaen suljetun Mad2-Mad1-kompleksin. Ottaen huomioon, että Mad1:Mad2 on stabiili kompleksi ja sekä CDC20 että MAD1 sitovat Mad2:ta samassa sitoutumiskohdassa, on erittäin epätodennäköistä, että suljettu Mad2 vapauttaisi Mad1:n sitoutumaan Cdc20:een.
Malli, joka selittää Mad2-konformaation, joka pystyy sitoutumaan Cdc20:een, perustuu Mad1-Mad2-ydinkompleksin primaariseen muodostumiseen. Tässä mallissa ulkoinen avoin Mad2 rekrytoidaan Mad1:Mad2-matriisiin. Tämä Mad2:Mad2-vuorovaikutus on välttämätön konformaatiomuutosten ratkaisemiseksi, jotka sallivat avoimen Mad2-sidotun reunan vuorovaikutuksessa Cdc20:n kanssa. Sitten Cdc20:Mad2 hajoaa ja Mad1:Mad2 voi jälleen sitoa vapaan sytosolisen Mad2:n [8] .
Oletetaan, että kerran muodostuneet Cdc20:Mad2-kompleksit voivat tehostaa anafaasia odottavaa signaalia stimuloiden edelleen sytosolisen avoimen Mad2:n ja vapaan Cdc20:n konversiota Cdc20:ksi: suljettu Mad2-kompleksi. Tämä signaalin etenemisen diffuusio kinetokoorikomplekseista saattaa selittää, kuinka vain yhden pienen kinetokoorikohdan vapautuminen voi sulkea metafaasin siirtymisen anafaasiin kokonaan [9] .
Karan tarkistuspisteiden signaloinnista ja muiden karan tarkistuspisteiden kokoonpanoproteiinien, kuten Bub1 :n , BubR1 :n ja Bub3 :n, vaikutuksesta on vielä paljon selitettävää . BubR1 ja Bub3 voivat myös kompleksoida Cdc20:n, mutta tämä jää nähtäväksi, helpottavatko nämä proteiinit Cdc20:n sitoutumista Mad2:n avaamiseen [9] .
On myös erittäin epäselvää, kuinka p31comet vastustaa tarkistuspistettä ja edistää Mad2-Cdc20-dissosiaatiota. De Antoni ym. ehdottavat, että yhdessä "Matrix Mad2:n" kanssa p31-komeetta kilpailee avoimen Mad2:n kanssa sitoutumisesta suljettuun Mad2:een: Mad1. Testejä tehdään sen selvittämiseksi, kuinka p31comet voi vaimentaa karan tarkistuspisteitä [10] .