Täydentävä DNA

Komplementaarinen DNA (cDNA, eng.  cDNA ) on DNA :ta, joka on syntetisoitu kypsällä mRNA-templaatilla käänteiskopioijaentsyymin katalysoimassa reaktiossa .

cDNA: ta käytetään usein eukaryoottisten geenien kloonaamiseen prokaryooteissa . Retrovirukset ( HIV-1 , HIV-2 , Simian Immunodeficiency Virus) tuottavat myös komplementaarista DNA:ta , minkä jälkeen se integroituu isäntä-DNA:han muodostaen proviruksen . [yksi]

Molekyylibiologian keskeinen dogma olettaa, että proteiinisynteesin aikana DNA transkriptoituu mRNA:ksi ja mRNA transloituu sitten proteiineihin. Yksi ero prokaryoottien ja eukaryoottien välillä on se, että eukaryoottigeenit voivat sisältää introneita , ei-koodaavia sekvenssejä, jotka leikataan pois epäkypsästä mRNA:sta silmukointiprosessin aikana. Prokaryoottiset geenit eivät sisällä introneita, joten prokaryoottiset mRNA:t eivät silmukoidu. [2]

Usein eukaryoottisia geenejä voidaan ilmentää prokaryoottisoluissa. Yksinkertaisimmassa tapauksessa menetelmä sisältää eukaryoottisen DNA:n lisäämisen prokaryoottisen genomiin, sitten DNA:n transkription mRNA:ksi ja sitten mRNA :n kääntämisen proteiineihin. Prokaryoottisoluissa ei ole intronia leikkaavia entsyymejä, ja siksi intronit on leikattava eukaryootti-DNA:sta ennen niiden liittämistä prokaryootin genomiin . DNA:ta, joka on komplementaarinen kypsän mRNA:n kanssa, kutsutaan siten komplementaariseksi DNA:ksi - cDNA (cDNA). Eukaryoottisen cDNA:n koodaamien proteiinien onnistunut ilmentyminen prokaryooteissa vaatii myös prokaryoottisten geenien säätelyelementtejä (esim. promoottorit ).

Yksi menetelmistä tarvittavan geenin (DNA-molekyylin) saamiseksi, joka on alttiina replikaatiolle (kloonaukselle) vapauttamalla huomattava määrä replikoita, on komplementaarisen DNA:n (cDNA) rakentaminen mRNA:lle. Tämä menetelmä edellyttää käänteiskopioijaentsyymin käyttöä, entsyymiä, jota esiintyy joissakin RNA-viruksissa ja joka mahdollistaa DNA:n synteesin RNA-templaatista.

Menetelmää käytetään laajalti cDNA:n saamiseksi, ja se sisältää sellaisen mRNA:n eristämisen kokonais-mRNA:sta, joka koodaa tietyn proteiinin (esimerkiksi interferonin, insuliinin) translaatiota, ja tämän mRNA:n lisäsynteesiä tarvittavan cDNA:n templaattina käänteiskopioijaentsyymin avulla. .

Yllä olevalla menetelmällä saatu geeni (cDNA) on vietävä bakteerisoluun siten, että se integroituu sen genomiin. Tätä varten muodostetaan rekombinantti-DNA, joka koostuu cDNA:sta ja erityisestä DNA-molekyylistä, joka hallitsee johtimena tai vektorina, joka pystyy tunkeutumaan vastaanottajan soluun. Viruksia tai plasmideja käytetään vektoreina cDNA:lle. Plasmidit ovat pieniä pyöreitä DNA-molekyylejä, jotka sijaitsevat erillään bakteerisolun nukleoidista, sisältävät useita koko solun toiminnalle tärkeitä geenejä (esimerkiksi antibioottiresistenssigeenejä ja voivat replikoitua solun päägenomista (DNA) riippumatta Geenitekniikassa käyttökelpoisten plasmidien biologisesti tärkeitä ja käytännöllisesti katsoen hyödyllisiä ominaisuuksia ovat niiden kyky siirtyä solusta toiseen transformaatio- tai konjugaatiomekanismin avulla sekä kyky liittyä bakteerin kromosomiin ja replikoitua sen mukana.

Muistiinpanot

1. ↑ Glik B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Periaatteet ja soveltaminen. - Moskova: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .
2. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Solun molekyylibiologia: kolmessa osassa. - 2. - Moskova: Mir, 1994. - T. 1. - 517 s. - 10 000 kappaletta.  — ISBN 5030019855 .