Yhdistetty immunosorbenttimääritys

Kokeneet kirjoittajat eivät ole vielä tarkistaneet sivun nykyistä versiota, ja se voi poiketa merkittävästi 30.6.2022 tarkistetusta versiosta . tarkastukset vaativat 11 muokkausta .

Entsyymi- immunomääritys (lyhennetty ELISA , englanniksi  entsyymi-linked immunosorbent assay, ELISA ) on laboratorioimmunologinen menetelmä erilaisten pienimolekyylisten yhdisteiden, makromolekyylien, virusten jne. kvalitatiiviseen tai kvantitatiiviseen määritykseen, joka perustuu spesifiseen antigeeni - vasta -ainereaktioon. . Muodostuneen kompleksin havaitseminen suoritetaan käyttämällä entsyymiä signaalin rekisteröinnin leimana. ELISA:n teoreettiset perusteet perustuvat nykyaikaiseen immunokemiaan ja kemialliseen entsymologiaan, antigeeni-vasta-ainereaktion fysikaalis-kemiallisten lakien tuntemiseen sekä analyyttisen kemian perusperiaatteisiin.

ELISA on yksi aktiivisesti kehittyvistä kemiallisen entsymologian alueista. Tämä johtuu siitä, että ELISA:ssa immunokemiallisen reaktion ainutlaatuinen spesifisyys (eli vasta -aineet sitoutuvat yksinomaan tiettyihin antigeeneihin , eivät mihinkään muihin) yhdistyy entsyymileiman havaitsemisen korkeaan herkkyyteen (jopa 10–21 mol ). näytteessä). Reagenssien korkea stabiilisuus, rekisteröintimenetelmien yksinkertaisuus, mahdollisuus luoda kaskadijärjestelmiä erilaisten kemiallisten signaalien vahvistamiseen, suhteellisen alhainen hinta ja monet muut ELISA-menetelmän edut ovat osaltaan edistäneet sen laajaa käyttöönottoa lääketieteen ja maatalouden eri aloilla. mikrobiologiassa ja elintarviketeollisuudessa, ympäristönsuojelussa sekä myös tieteellisessä tutkimuksessa. [yksi]

Teoreettiset perusteet

Tutkimuskohteiden moninaisuuden vuoksi - alhaisen molekyylipainon yhdisteistä, peptidi- ja steroidihormoneista, farmakologisista valmisteista, torjunta-aineista viruksiin ja bakteereihin ja jopa muihin vasta-aineisiin - sitoutumisperiaatteiden ja ELISA:n suorittamisen olosuhteiden vaihtelevuus, tälle menetelmälle on olemassa suuri määrä vaihtoehtoja. Pelkästään entsymaattisen aktiivisuuden rekisteröintiin on mahdollista käyttää fotometrisiä, fluorometrisiä, bio- ja kemiluminesenssimenetelmiä, ja joissakin tapauksissa (erityisesti teknisten ongelmien ratkaisemiseen liittyvissä) käytetään menestyksekkäästi sähkökemiallisia ja mikrokalorimetrisiä antureita.

Vuorovaikutuksen fysikaaliset ja kemialliset perusteet

Immunokemiallinen reaktio liuoksessa etenee useissa vaiheissa, joista ensimmäinen on reversiibeli kompleksin muodostuminen vasta-aineiden ja antigeenien välillä koostumuksen ollessa 1:1 (koska moniarvoisten antigeenien vasta-ainemolekyylissä on useampi kuin yksi sitoutumiskohta , monivaiheinen monivaiheisten kompleksien muodostaminen eri komponenttien suhteilla on mahdollista). Kompleksien muodostumista välittävät hydrofobiset , ioniset , van der Waalsin ja vetysidokset . Merkittävin rooli on hydrofobisen vuorovaikutuksen voimilla, jotka stabiloivat koko järjestelmää (vähentävät sen vapaata energiaa ja lisäävät entropiaa ). Tällaisten vuorovaikutusten tehokkuus kasvaa lämpötilan noustessa.

Yksinkertaisimmassa tapauksessa yhden vasta-aineen sitoutumiskohdan ( AT ) vuorovaikutus monovalenttisen antigeenin ( AG ) kanssa voidaan esittää kaaviolla.

.

Kvantitatiivisella puolella antigeeni-vasta-ainevuorovaikutuksen spesifisyyttä luonnehditaan vasta-aineiden affiniteetilla tai immunokompleksin Ka muodostumisen tasapainovakiolla (sisäinen affiniteetti, l / mol):

,

missä [ AG ], [ AT ] ja [ AG × AT ] ovat vastaavasti vapaan antigeenin, vapaan vasta-aineen ja antigeeni-vasta-ainekompleksin tasapainopitoisuudet. Käytännössä käytetään usein kompleksin Kd (mol/L) tasapainodissosiaatiovakiota , joka liittyy Ka:han yksinkertaisella suhteella.

Ilmeisesti mitä pienempi Kd (tai päinvastoin, mitä suurempi Ka ), sitä vahvempi on tuloksena oleva immunokompleksi.

Kompleksin muodostusvakio on termodynaaminen parametri, joka luonnehtii muutosta antigeeni-vasta-ainevuorovaikutuksen vapaassa energiassa ja joka voidaan laskea kaavalla:

,

missä R  on kaasuvakio, T  on absoluuttinen lämpötila. Vapaan energian kokonaismuutos kompleksin muodostumisen aikana on kahden termodynaamisen suuren summa - entalpian ja entropian muutokset :

.

Antigeeni-vasta-ainereaktio etenee lämmön vapautuessa, mutta pääsääntöisesti entalpian muutos on pieni ja on noin 40 kJ/mol. Muutos entropiassa on useimmissa tapauksissa positiivinen, koska vasta-aineiden aktiiviset keskukset vapaassa muodossa ovat liuottimen käytettävissä ja hydratoituvat, ja vuorovaikutuksessa antigeenin kanssa niistä vapautuu sitoutuneita vesimolekyylejä, mikä johtaa vasta-aineiden alenemiseen. järjestelmän yleinen järjestys. Siten vasta-aineiden immunologisesta spesifisyydestä puhuttaessa suoritetaan aina vertaileva arvio antigeeni-vasta-aineen tehokkuudesta, jolle on tunnusomaista tasapainovakio tai muutos järjestelmän vapaassa energiassa kompleksin muodostumisen aikana.

Antigeenin vuorovaikutus vasta-aineiden alapopulaation kanssa

Aikaisemmin yksinkertainen malli monovalenttisen antigeenin ja monovalentin vasta-aineen vuorovaikutuksesta otettiin perustaksi antigeeni-vasta-aine-vuorovaikutuksen tehokkuuden kvantitatiiviselle kuvaukselle. Mutta koska vasta-ainemolekyylissä on useita antigeenia sitovia keskuksia ja lisäksi se kykenee olemaan vuorovaikutuksessa yhden antigeenimolekyylin useiden antigeenideterminanttien kanssa, tämä immunokemiallisen kompleksin muodostumisen ominaisuus on hyvin yksinkertaistettu. Kuvaamaan moniarvoisen vasta-aineen ja polyvalentin antigeenin vuorovaikutusprosessia, joka on lähempänä todellisuutta, on otettu käyttöön termi aviditeetti tai toiminnallinen affiniteetti ( funktionaalinen affiniteetti ). Biologisesta näkökulmasta katsottuna funktionaalinen affiniteetti on päärooli immuunivasteessa kehon tartunnalle viruksilla tai bakteereilla, joiden pinnalla on toistuvia antigeenideterminantteja.

1:1 antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumisprosessi, jossa toteutetaan moniarvoisia vuorovaikutuksia, on myös palautuva ja voidaan karakterisoida kompleksoitumisvakiolla . Energisestä näkökulmasta moniarvoisen kompleksin muodostaminen on paljon edullisempaa kuin yksiarvoisen kompleksin. Esimerkiksi IgG:n tehokas kompleksoitumisvakio voi olla 1000 kertaa tai enemmänkin suurempi kuin yksinkertaisen sidoksen vakio.

Entsyymien katalyyttiset ominaisuudet

Erittäin tärkeä ja käytännössä usein käytetty entsyymien ominaisuus on niiden katalyyttinen aktiivisuus . Minkä tahansa entsyymin katalyyttisen aktiivisuuden yksikkö (1 kataali) otetaan sellaiseksi määräksi, joka katalysoi 1 moolin substraattia muuttumisen 1 sekunniksi reaktioseoksessa tietyissä olosuhteissa. Käytännön tarkoituksiin nanocatal ( 10–9 cat) on kätevin. Kuitenkin vanhaa katalyyttisen aktiivisuuden nimitystä, joka tunnetaan nimellä kansainvälinen yksikkö ( IU , englanniksi U ), käytetään edelleen usein , ja se määritellään entsyymimääräksi, joka katalysoi 1 mmol:n substraatin konversion 1 minuutissa. Näiden yksiköiden välinen suhde on seuraava:

1 nkat \u003d 10 -9 kissa \u003d 0,06 U.

Erilaisten entsyymivalmisteiden vertailevaan arviointiin käytetään usein spesifistä katalyyttistä aktiivisuutta , toisin sanoen katalyyttistä aktiivisuutta proteiinin massayksikköä kohti.

Entsymaattisen reaktion nopeuteen vaikuttavat useat tekijät, joista tärkeimmät ovat:

  1. lämpötila,
  2. puskurin luonne ja pH ,
  3. substraatit,
  4. koentsyymit ,
  5. efektorit,
  6. proteiinin määrä järjestelmässä.

Lämpötilariippuvuudet ovat monimutkaisia, mikä johtuu sekä proteiinimolekyylien lämpöherkkyydestä että lämpötilan vaikutuksesta Michaelis -vakioihin, yksittäisten entsyymi-substraattikompleksien hajoamisnopeusvakioihin sekä pH - optimin asemaan. Alhaisissa lämpötiloissa, kun aktiivisen keskuksen rakenne on riittävän vakaa, entsyymi-substraattikompleksin hajoamisnopeusvakio kuvataan Arrhenius -tyyppisellä yhtälöllä .

pH - optimaalisen aktiivisuuden alue voi olla melko kapea. Se riippuu ionivahvuudesta ja käytetyn puskurin tyypistä ja vaihtelee lämpötilan mukaan. Esimerkiksi alkalisen fosfataasin pH -optimi lämpötiloissa 37, 30 ja 25 °C on 9,9; 10.1 ja 10.3.

Määritetty katalyyttinen aktiivisuus riippuu voimakkaasti käytetystä substraatista, joka voi olla sekä luonnollista että synteettistä, mutta myös niiden konversionopeudet vaihtelevat merkittävästi. Esimerkiksi entsyymi β - D -galaktosidaasi hydrolysoi synteettiset substraatit 2-nitrofenyyli-β- D - galaktosidin ja 4-nitrofenyyli-β- D - galaktosidin, vastaavasti, 7 ja 17 kertaa nopeammin kuin luonnollinen substraattilaktoosi.

Efektoreihin kuuluvat sekä entsymaattisten reaktioiden inhibiittorit että aktivaattorit eli aineet, jotka hidastavat tai kiihdyttävät substraatin transformaatiota. Joissakin tapauksissa substraattien korkeat pitoisuudet tai jokin reaktiotuotteista estävät entsymaattisia reaktioita. Effektorien läsnäolo reaktioväliaineessa voi johtaa entsymaattisen reaktionopeuden ei-toivottuun poikkeamiseen lineaarisesta suhteesta entsyymimäärään systeemissä.

Kokeelliset menetelmät entsymaattisen aktiivisuuden määrittämiseksi

Fotometrinen menetelmä

ELISA:ssa, yleisimmin käytetty fotometrinen menetelmä entsyymiaktiivisuuden tallentamiseen. Tällöin entsyymisubstraatteina käytetään aineita, joiden konversiotuotteet ovat värillisiä yhdisteitä tai päinvastoin itse substraattien väri muuttuu reaktion aikana. Värilliset yhdisteet absorboivat näkyvää valoa eli sähkömagneettista säteilyä aallonpituuksilla 400-700 nm. Valon absorptio noudattaa Bouguer-Lambert-Beer-lakia , jonka mukaan liuoksen optinen tiheys tietyllä alueella on suoraan verrannollinen aineen pitoisuuteen. Spektrofotometriä käytetään optisen tiheyden mittaamiseen.

Fluorimetrinen menetelmä

Viime aikoina ELISA:ssa ovat yleistyneet substraatit, jotka muodostavat tuotteita, jotka havaitaan fluorimetrisellä menetelmällä . Kun molekyyli absorboi fotonin, se siirtyy peruselektronitilasta virittyneeseen. Kiihtynyt molekyyli voi palata perustilaan, kun taas ylimääräinen energia muuttuu lämmöksi, mutta elektronien siirtyminen maanpinnalle voi tapahtua käänteisessä prosessissa, johon liittyy valokvantin vapautuminen, jota kutsutaan fluoresenssiksi. Johtuen osittaisesta energiahäviöstä molekyylin siirtyessä viritetystä tilasta perustilaan, emittoidun valon aallonpituus on aina suurempi kuin absorboidun valon aallonpituus. Kvanttisaanto Φ määrää molekyylien osuuden, joka on siirtynyt virittyneestä tilasta perustilaan valoa emittoimalla. Fluoresenssin intensiteetti on verrannollinen näytteen adsorboiman valon määrään. Siten se on suoraan verrannollinen liuenneen aineen pitoisuuteen ja alkuperäisen valon voimakkuuden absoluuttiseen arvoon, kun taas fotometria vertaa näytteen adsorboimia suhteellisia intensiteettejä. Tämä seikka mahdollistaa liuoksessa olevan aineen määrityksen herkkyyden lisäämisen fluorimetrisellä menetelmällä 1–2 suuruusluokkaa verrattuna fotometriseen menetelmään.

Bioluminesenssi ja kemiluminesenssi

Havaitsemisjärjestelminä ELISA:ssa on käytetty entsymaattisia reaktioita, joiden energia realisoituu valosäteilyn muodossa - bio- ja kemiluminesenssin reaktioissa . Tällaisten reaktioiden nopeutta seurataan reaktiojärjestelmän hehkun voimakkuudella, joka kirjataan luminometrillä. Bioluminesenssireaktioita katalysoivat tulikärpästen ja bakteerien lusiferaasit, ja syklisten hydratsidien hapettumisreaktiota vetyperoksidin kanssa (kemiluminesenssireaktio) katalysoi piparjuuriperoksidaasi.

Sähkökemiallinen menetelmä

Tunnetaan myös sähkökemiallisia menetelmiä immuunimäärityksissä leimoina käytettyjen entsyymien aktiivisuuden määrittämiseksi. Sellaiset anturit mahdollistavat entsymaattisten reaktioiden nopeuden määrittämisen sameassa väliaineessa ja ovat käteviä läpivirtausimmunomäärityssolujen luomiseen.

Entsyymi-immunomääritysmenetelmissä sekä entsyymejä että niiden substraatteja voidaan käyttää antigeenien ja vasta-aineiden leimoina. Jos entsyymimolekyyli toimii leimana, niin valitun havainnointimenetelmän tulee varmistaa signaalin rekisteröinti suhteessa entsyymipitoisuuteen ja substraattia käytettäessä leimana substraattipitoisuuteen. Ensimmäisessä tapauksessa entsyymi toimii markkerina (se on kovalenttisesti sitoutunut antigeeniin tai vasta-ainemolekyyliin), toisessa se toimii detektorina (vapaa entsyymi). Kun kaikki ELISA-menetelmän immunokemialliset vaiheet on suoritettu, on tarpeen määrittää immunokemiallisen reaktion entsyymileimatun komponentin pitoisuus, toisin sanoen määrittää entsyymin katalyyttinen aktiivisuus näytteessä. Havaittua reaktionopeutta käytetään arvioimaan markkerientsyymin pitoisuutta järjestelmässä. On huomattava, että ELISA perustuu aina vertailevaan määritykseen standardin ja mitatun näytteen identtisissä olosuhteissa, ja siksi nopeuden ja pitoisuuden suhteellisuusvaatimus on toivottavampi kuin pakollinen. Riittää, että muodostuneen entsymaattisen reaktiotuotteen määrän ja järjestelmässä olevan entsyymin määrän välillä on yksi yhteen vastaavuus. Suhteellisuusehdon täyttyminen tietyllä pitoisuusalueella varmistaa kuitenkin kokeen suuremman tarkkuuden ja mahdollistaa menetelmää kuvaavan teoreettisen mallin rakentamisen sen optimointiin.

ELISA-leimoina käytetyt entsyymit

Perusmahdollisuus käyttää entsyymejä ELISA-leimoina johtuu entsyymien havaitsemisen erittäin korkeasta herkkyydestä liuoksessa. Jos tavanomaisilla spektrofotometrisilla tai fluorimetrisillä menetelmillä voidaan rekisteröidä tuotteen muodostuminen pitoisuudessa 10 -7 mol/l, niin entsyymin pitoisuus on 10 -13 mol/l. Lisäksi on pohjimmiltaan mahdollista vähentää merkittävästi entsyymien havaitsemisrajoja sekä pidentämällä entsymaattisen reaktion aikaa että lisäämällä muodostuneen tuotteen rekisteröintiherkkyyttä. Tältä osin lupaavia ovat luminesenssimenetelmät entsymaattisten reaktioiden havaitsemiseksi sekä menetelmät, jotka perustuvat primaarisen entsymaattisen reaktion tuotteiden ("kaskadit") havaitsemisen entsymaattiseen tehostamiseen.

Entsyymileimojen valinnalle ELISA:ssa on useita yleisiä vaatimuksia. Tärkeimmät ovat seuraavat:

  1. korkea spesifisyys ja spesifinen katalyyttinen aktiivisuus, mikä mahdollistaa leiman havaitsemisen pienillä pitoisuuksilla;
  2. entsyymin saatavuus, mahdollisuus saada riittävän puhtaita entsyymivalmisteita, jotka säilyttävät korkean aktiivisuuden kemiallisen modifioinnin jälkeen, kun saadaan konjugaatti antigeenien tai vasta-aineiden kanssa;
  3. stabiilisuus optimaalisissa olosuhteissa antigeenin vuorovaikutukselle vasta-aineen kanssa;
  4. entsyymipitoisuuden määritysmenetelmän yksinkertaisuus ja herkkyys.

Yleisimmät heterogeenisessä ELISA:ssa (jossa käytetään kiinteiden kantajien pinnalle immobilisoituja reagensseja) ovat piparjuuriperoksidaasi , alkalinen fosfataasi ja β - D - galaktosidaasi . Kaikki kolme entsyymiä määritetään pikomolaaristen pitoisuuksien tasolla.

Yleisimmin saatavilla oleva on piparjuuriperoksidaasi. Se sisältää perjodaatin helposti hapettavia hiilihydraattijäämiä, joiden kautta entsyymi voi sitoutua vasta-aineisiin tai antigeeneihin. Peroksidaasin aktiivisuuden mittaamiseen fotometrisella menetelmällä käytettävän substraattijärjestelmän koostumus sisältää kromogeenejä, jotka antavat värillisiä yhdisteitä peroksidilla hapetettaessa.

Glukoosioksidaasin katalyyttinen aktiivisuus kirjataan samoilla kromogeeneillä kuin peroksidaasin aktiivisuus, mutta sen määrityksen herkkyys verrattuna peroksidaasiin on jonkin verran pienempi. Entsyymin tärkein etu on sen täydellinen puuttuminen veriplasmassa, mikä mahdollistaa tämän entsyymin käytön homogeenisissa ELISA-menetelmissä (ELISA:n kaikkien vaiheiden reagenssit ovat vesiliuoksessa).

Alkalisella fosfataasilla ja sen konjugaateilla on korkea stabiilisuus ja alhainen havaitsemisraja, mutta niillä on suhteellisen korkea hinta. On kehitetty yliherkkiä entsymaattisia järjestelmiä, jotka mahdollistavat useiden tuhansien alkalisen fosfataasimolekyylien havaitsemisen liuoksessa perustuen NADP -molekyylin käyttöön substraattina . Entsymaattisesta hydrolyysistä saatu NAD -tuote määritetään entsymaattisen kofaktorin regenerointijärjestelmässä.

P - D - galaktosidaasi on myös laajalti käytetty entsyymi sekä homogeenisessa että heterogeenisessä ELISA:ssa. Se katalysoi laktoosin hydrolyysiä glukoosiksi ja galaktoosiksi. Jos luonnollisen substraatin sijasta otetaan 4-metyyliumbelliferyyli-β- D - galaktosidia, hydrolyysin aikana muodostuu galaktoosia ja 4-metyyliumbelliferonia, joka havaitaan fluorimetrisesti.

Kaikissa kaupallisissa testijärjestelmissä käytetään piparjuuriperoksidaasia, jonka valinnan määrää sen korkea spesifinen katalyyttinen aktiivisuus, saatavuus, stabiilisuus ja havaitsemisen helppous. Substraattireagenssina käytetään useimmiten ortofenyleenidiamiinia (OPD) tai tetrametyylibentsidiiniä (TMB) vetyperoksidin kanssa, jonka hapettumistuote rekisteröidään fotometrisesti. Entsymaattisen reaktion pysäyttämiseksi käytetään "pysäytysreagenssia", jota lisätään kaikkiin testi- ja kontrollinäytteisiin yhtä suurena määränä. Useimmiten rikkihappoa käytetään "pysäytysreagenssina". Tulosten huomioiminen suoritetaan spektrofotometrisesti aallonpituudella 450-490 nm.

ELISA-menetelmien luokittelu

Tähän mennessä ELISA:n suorittamiseen on kehitetty suuri määrä erilaisia ​​vaihtoehtoja, joissa on sekä perustavanlaatuisia että pieniä eroja. Kirjallisuudessa ei ole yhtä selkeää luokittelua ELISA-menetelmien koko valikoimalle, mikä vaikeuttaa yhteisten mallien tunnistamista ja eri menetelmien ominaisuuksien vertailevaa arviointia. Yleensä ELISA-menetelmien tarkastelu suoritetaan heterogeenisten ja homogeenisten erottelun näkökulmasta, eli periaatteen mukaisesti, että kaikki analyysivaiheet suoritetaan kiinteän faasin kanssa tai vain liuoksessa.

ELISA:n ensisijainen prosessi on vaihe, jossa sille spesifinen vasta-aine "tunnistaa" analysoitavan yhdisteen. Koska immunokemiallisten kompleksien muodostumisprosessi tapahtuu tiukasti kvantitatiivisessa suhteessa, johtuen affiniteetista, komponenttien pitoisuuksista ja reaktio-olosuhteista, on riittävää määrittää analysoitavan yhdisteen alkuperäinen pitoisuus on saatujen immuunikompleksien kvantitatiivinen arvio. Antigeenianalyysin tapauksessa tämän arvioinnin tekemiseen on kaksi lähestymistapaa:

  1. muodostuneiden kompleksien pitoisuuden suora mittaus;
  2. jäljellä olevien vapaiden (reagoimattomien) vasta-aineiden pitoisuuden määrittäminen.

Ilmeisesti jälkimmäisessä tapauksessa muodostuneiden immuunikompleksien lukumäärä määräytyy lisättyjen vasta-aineiden kokonaismäärän ja vapaiksi jääneiden vasta-aineiden lukumäärän välisen eron perusteella.

Klassiset ELISA-menetelmät perustuvat saostuman (sakan) muodostumiseen vasta-aineilla antigeenin läsnä ollessa, mutta saostusprosessin visuaalinen rekisteröinti edellyttää suuria komponenttipitoisuuksia ja pitkää reaktioaikaa. Lisäksi tällaisen analyysin tuloksia ei aina voida tulkita yksiselitteisesti, ja useimmissa tapauksissa ne ovat luonteeltaan laadullisia tai puolikvantitatiivisia. Lisäksi monille yksiarvoisille antigeeneille ( hapteeneille ), kuten hormoneille ja lääkeyhdisteille, nämä menetelmät eivät sovellu. Muodostuneen antigeeni-vasta-ainekompleksin indikointi liuoksessa voidaan suorittaa, jos johonkin reaktiosysteemin alkukomponentista viedään leima, joka on helposti havaittavissa vastaavalla erittäin herkällä fysikaalis-kemiallisella menetelmällä. Isotooppiset, entsymaattiset, fluoresoivat, paramagneettiset leimat osoittautuivat erittäin sopiviksi tähän tarkoitukseen, joiden käyttö mahdollisti immunokemiallisten menetelmien herkkyyden lisäämisen miljoonilla kertoilla ja lyhensi analyysiaikaa useisiin tunteihin. Koska kompleksinmuodostusprosessi tapahtuu tiukasti kvantitatiivisessa mielessä, kompleksiin sisältyvän leiman konsentraatio liittyy ainutlaatuisesti antigeenin alkupitoisuuteen.

Heterogeeninen ELISA mikrolevymuodossa

Kompleksoinnin tehokkuuden analysoimiseksi on välttämätöntä puhdistaa kompleksit täysin vapaista komponenteista. Tämä ongelma osoittautui helposti ratkaistavaksi, jos jokin antigeeni-vasta-aine-parin komponenteista on tiukasti sidottu ( immobilisoitu ) kiinteälle kantajalle. Immobilisointi mahdollistaa aggregaation estämisen liuoksessa ja syntyneiden kompleksien fyysisen erottamisen vapaista komponenteista. Vasta-aineiden immobilisoinnin käyttö kiinteälle kantajalle loi perustan kiinteän faasin (heterogeenisen) ELISA- menetelmille .

Erityisen tärkeää kiinteän faasin ELISA:n laajalle käyttöönotolle käytännössä oli sellaisten erityisten polystyreenilevyjen kehittäminen, jotka sisälsivät 96 kuoppaa kantajina vasta-aineiden ja antigeenien sorptioimmobilisaatioon. Vasta-aineiden sorptio polystyreenin pinnalle todettiin 60-luvun puolivälissä ja sitä käytettiin alun perin radioimmunomääritysmenetelmissä (RIA) . Polystyreenilevyjen käyttöönotto ELISA-käytännössä mahdollisti huomattavasti suoritettujen analyysien määrän lisäämisen ja yksinkertaisti sen toteuttamisen metodologista menettelyä. Erikoislaitteet suunniteltiin automatisoimaan reagenssien lisäämisen, pesun vaiheet ja samanaikaisesti leimaentsyymin katalyyttisen aktiivisuuden kirjaaminen levyn jokaiseen kuoppaan. [yksi]

Heterogeeninen (kiinteäfaasi) ELISA mikrolevyversiona on yleisimmin käytetty testijärjestelmissä kliinisissä laboratoriotutkimuksissa. Kiinteänä faasina käytetään polystyreenimikrolevyn kuoppien pintaa, jolle on adsorboitu testijärjestelmään sisältyvät tunnetut antigeenit tai vasta-aineet (kutsutaan tässä tapauksessa immunosorbenteiksi ). Immunosorbentin spesifisen reaktion aikana testinäytteessä määritettyjen vasta-aineiden tai antigeenien kanssa muodostuu immuunikomplekseja, jotka kiinnittyvät kiinteään faasiin. Aineet, jotka eivät osallistuneet reaktioon, sekä ylimääräiset reagenssit poistetaan toistuvan pesun aikana. Käytetään konjugaatteja - vasta-aineita havaittavalle aineelle, jotka on kytketty tiettyyn leimaan (esimerkiksi piparjuuriperoksidaasi- , alkalinen fosfataasi- , β-D-galaktosidaasi-, ruteeni- tai fluoreseiinientsyymi), joka on entsymaattisen reaktion katalysaattori. [2] Tämä kaavio mahdollistaa reaktiokomponenttien tehokkaan erotteluprosessin yksinkertaistamisen. [3]

Ei-kilpailevat ELISA-menetelmät

Jos järjestelmässä on vain analysoitu yhdiste ja sitä vastaavat sitoutumiskeskukset (antigeeni ja spesifiset vasta -aineet ), menetelmä ei ole kilpaileva .

Suora ELISA

Käytetään antigeenin määrittämiseen. Voidaan tehdä kahdella tavalla. Ensimmäisessä lisätty materiaali (antigeeni) kiinnitetään inkuboinnin aikana puhtaiden kuoppien pinnalle. Testimateriaalin määrä havaitaan käyttämällä konjugaattia. Toisessa vasta-aineet immobilisoidaan kuoppaan ja testiaine, joka on aiemmin leimattu entsyymillä, havaitaan.

Analyysin rakenne.

Biologista materiaalia (veri, limakalvojen naarmut, sivelyt) laitetaan puhtaisiin kuoppiin joksikin aikaa (yleensä 15-30 minuutiksi), joka riittää antigeenien kiinnittymiseen kuoppien pintaan.

Seuraavaksi kuoppiin lisätään leimattuja vasta-aineita havaitulle antigeenille (konjugaatti). Tämä tarkoittaa, että havaittaessa antigeenejä, esimerkiksi kuppaa, lisätään kupan antigeenejä vastaan ​​vasta-aineita. Tätä seosta jätetään jonkin aikaa (30 minuutista 4-5 tuntiin), jotta konjugaatin vasta-aineet voivat löytää "oman" antigeeninsä ja sitoutua siihen. Mitä enemmän antigeenejä biologisessa näytteessä on, sitä enemmän vasta-aineita niihin sitoutuu. Koska vasta-aineita lisätään ylimäärin, ne eivät kaikki sitoudu antigeeneihin, ja jos näytteessä ei ole lainkaan antigeeniä, niin vastaavasti yksikään vasta-aine ei sitoudu haluttuun antigeeniin. "ylimääräisten" vasta-aineiden poistamiseksi kuoppien sisältö kaadetaan (tai pestään pois dekantoimalla ). Seurauksena on, että jäljelle jää vain ne, jotka ovat olleet kosketuksissa kuoppien pintaan "liimattuihin" antigeeneihin.

Seuraava vaihe on entsymaattinen reaktio. Lisää pestyihin kuoppiin liuos entsyymin kanssa ja anna seistä 30-60 minuuttia. Tällä entsyymillä on affiniteettia ainetta kohtaan (spesifinen leima), johon vasta-aineet ovat sitoutuneet. Entsyymi suorittaa reaktion, jonka seurauksena tämä erityinen leima (substraatti) muuttuu värilliseksi aineeksi (tuotteeksi).

Lyhyt kaavio: (Antigeeni) → Vasta-aine

Koska lisätty spesifinen leima liittyy vasta-aineisiin ensimmäisessä menetelmässä tai leimattuihin antigeeniin toisessa, se tarkoittaa, että värillisen reaktiotuotteen pitoisuus on yhtä suuri kuin analyytin pitoisuus. [2]

Epäsuora ei-kilpaileva ELISA

Käytetään vasta-aineiden havaitsemiseen. Testibiologinen materiaali (useimmiten ihmisen seerumi tai plasma), joka sisältää tai ei sisällä antigeenin vasta-aineita, syötetään kuoppiin, joiden kiinteälle pinnalle antigeeni alustavasti sorboidaan. Sitoutuneiden vasta-aineiden määrä havaitaan käyttämällä niihin konjugaattia.

Analyysin rakenne.

Testatut vasta-aineet biologisesta materiaalista syötetystä näytteestä sitoutuvat antigeeniin inkuboinnin aikana ja siten immobilisoituvat kuopan pintaan. Sitoutumattomat vasta-aineet poistetaan pesemällä.

Konjugaatti, joka pystyy sitoutumaan ensimmäisessä vaiheessa immobilisoituun vasta-aineeseen, viedään kuoppaan. Jos solu sisältää ensimmäisessä vaiheessa muodostuneita immuunikomplekseja, konjugaatti yhdistyy niiden kanssa toisen inkubaation aikana, ja sitoutumaton konjugaatti poistetaan myöhemmällä pesulla.

Seuraavaksi kuoppaan lisätään substraattikromogeeninen reagenssi, joka muuttuu värilliseksi tuotteeksi konjugaatin entsyymikomponentin vaikutuksesta. [3]

Lyhyt kaavio: Antigeeni → (vasta-aine) → vasta-aine-K

Erona suoraan menetelmään siis on se, että testatut vasta-aineet eivät tartu puhtaan kuopan pintaan, vaan sitoutuvat levylle immobilisoituun antigeeniin.

"Sandwich"

Käytetään antigeenin määrittämiseen. "Sandwich" on epäsuoran ei-kilpailevan heterogeenisen ELISA:n variantti, jossa primaariset vasta-aineet immobilisoidaan levylle. [3]

Analyysin rakenne.

Liuos, joka sisältää analysoitua antigeeniä, lisätään kantajaan immobilisoitujen vasta-aineiden kanssa. Ensimmäisessä vaiheessa tapahtuvassa inkubaatioprosessissa kiinteälle faasille muodostuu antigeeni-vasta-ainekompleksi.

Sitten kantaja pestään sitoutumattomista komponenteista ja lisätään konjugaatti.

Toissijaisen inkubaation ja ylimääräisen konjugaatin poistamisen jälkeen määritetään kantajan entsymaattinen aktiivisuus, joka on verrannollinen tutkittavan antigeenin alkupitoisuuteen. Entsymaattinen reaktio (värireaktio) tapahtuu vetyperoksidin ja substraatin läsnä ollessa, jota edustaa väritön yhdiste, joka hapettuu peroksidaasireaktion aikana värilliseksi reaktiotuotteeksi tutkimuksen viimeisessä vaiheessa. Värjäytymisen voimakkuus riippuu havaittujen spesifisten vasta-aineiden määrästä.

Tulos arvioidaan spektrofotometrisesti tai visuaalisesti.

Lyhyt kaavio: vasta-aine → (antigeeni) → vasta-aine-K

Spesifisen immunokompleksin tunnistamisvaiheessa antigeeni on ikään kuin kerrostettu immobilisoitujen ja leimattujen vasta-aineiden molekyylien väliin, mikä oli syy nimen "sandwich"-menetelmän laajaan käyttöön . Vasta-aineiden havaitsemiseen käytettävät testijärjestelmät toimivat samalla tavalla, mutta niissä käytetään antigeeniä immunosorbenttina ja konjugaatti sisältää entsyymillä leimatun antigeenin liuoksen.

"Sandwich"-menetelmällä voidaan analysoida vain niitä antigeenejä, joiden pinnalla on vähintään kaksi spatiaalisesti etäällä olevaa antigeenideterminanttia. Suuri määrä testijärjestelmiä entsyymi-immunomääritykseen eri infektioille perustuu tähän muotoon: HIV-infektio , virushepatiitti , sytomegalovirus , herpes , toksoplasma ja muut infektiot.

Tällä hetkellä testijärjestelmät, joissa käytetään streptavidiinia ja biotinyloituja monoklonaalisia vasta-aineita (jotka ovat sekoitus erittäin puhdistettuja spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita eri epitooppeja vastaan), ovat yleistyneet. Standardit, kontrollit ja potilasnäytteet lisätään streptavidiinilla päällystettyihin mikrokuopoihin, minkä jälkeen lisätään biotinyloidut vasta-aineet ja konjugaatti. Sekoituksen jälkeen reaktio johtaa "sandwich"-kompleksin muodostumiseen, joka sitoutuu streptavidiiniin soluissa. Sitoutumattomat osat poistetaan pesemällä. Substraattiliuoksen kanssa inkuboinnin jälkeen kuopissa olevien liuosten optinen tiheys määritetään fotometrisesti. Tällaisten järjestelmien ominaisuus on entsymaattisen reaktion etäisyys levyn seinämästä, jolloin väri kehittyy tilavuudessa ja testijärjestelmä tulee analyyttisesti herkemmäksi. [3]

Kilpailevat ELISA-menetelmät

Jos järjestelmän ensimmäisessä vaiheessa sekä analyytti että sen analogi (entsyymileimattu analyytti tai kiinteään faasiin immobilisoitu analyytti) ovat samanaikaisesti läsnä järjestelmässä kilpailemassa rajoitetusta määrästä spesifisiä sitoutumiskohtia, niin menetelmä on kilpailukykyinen . Tämän tyyppistä määritystä käytetään usein sellaisten antigeenien havaitsemiseen, joita esiintyy korkeina pitoisuuksina, tai hormonien, joilla on vain yksi antigeeniä sitova kohta, havaitsemiseen.

Kilpaileva ELISA-menetelmä on jaettu useisiin tyyppeihin: havaitsemistyypin mukaan (suora tai epäsuora) ja kiinteään faasiin immobilisoidun aineen tyypin mukaan (antigeeni tai vasta-aine).

Suora kilpailu ELISA

Käytetään antigeenin tai vasta-aineen havaitsemiseen. Jos antigeeni havaitaan, suora kilpaileva ELISA-formaatti käyttää erityisiä antigeenejä, jotka on immobilisoitu kiinteään faasiin. Kun testinäyte ja konjugaatti viedään, jälkimmäinen kilpailee sitoutumisesta näytteessä olevien (liuenneen) antigeenien ja immobilisoitujen antigeenien kanssa.

Analyysin rakenne.

Testinäyte (ihmisen seerumi tai plasma) ja konjugaatti lisätään tabletin kuoppaan, jonka pinnalle antigeenit adsorboituvat. Inkuboinnin jälkeen muodostuu kahden tyyppisiä immuunikomplekseja: assosioituneita ja ei-assosioituneita konjugaattiin, ts. sisältävät entsyymileiman (merkitty) ja ilman sitä (leimaamaton). Tabletti pestään. Mitä enemmän leimaamattomia vasta-aineita kuoppaan on jäljellä, sitä suurempi on kilpailu testinäytteen vasta-aineiden kanssa.

Lisäksi sen jälkeen, kun kantaja on pesty sitoutumattomista komponenteista, lisätään substraatti-kromogeeninen reagenssi ja kiinteään faasiin muodostuneiden spesifisten immuunikompleksien entsymaattinen aktiivisuus rekisteröidään. [3]

Lyhyt kaavio: Antigeeni → (Antigeeni) + Vasta-aine-K

Siten suoralla kompetitiivisella ELISA:lla saadun havaitun signaalin suuruus on käänteisessä suhteessa antigeenikonsentraatioon.

Vasta-aineiden havaitsemiseksi suoritetaan samanlainen versio suorasta kilpailevasta ELISAsta kiinteään faasiin immobilisoidulla vasta-aineella.

Suoran kaavion etuna on pieni vaiheiden määrä, mikä helpottaa analyysin automatisointia. Kaavion haittoja ovat entsyymikonjugaattien synteesimenetelmien monimutkaisuus sekä näytekomponenttien mahdollinen vaikutus entsyymin aktiivisuuteen.

Epäsuora (epäsuora) kilpailukykyinen ELISA

Käytetään antigeenin määrittämiseen. Kuten suorassa kilpailevassa menetelmässä, myös antigeeni immobilisoidaan kiinteään faasiin, mutta antigeeniin konjugaatin sijasta käytetään leimattuja leimattuja vasta-ainevasta-aineita (sekundaarisia vasta-aineita). Näytteeseen lisätään vasta-aineita, jotka kilpailevat sitoutumisesta joko koehenkilön veriseerumin antigeenin kanssa (vapaa, poistettu pesemällä) tai kiinteään faasiin immobilisoidun antigeenin kanssa (ei poistu pesulla). Seuraavaksi leimattujen vasta-aineiden konjugaatti kiinnitetään sitoutuneisiin vasta-aineisiin ja optinen tiheys määritetään. Eli jos syötetyssä näytteessä ei ole lainkaan mitattavissa olevaa ainetta, kaikki vasta-aineet sitoutuvat kaivon pinnalla olevan kantajaproteiinin kautta immobilisoituneeseen antigeeniin, ne jäävät kuoppaan pesun aikana ja havaittu signaali korkea. Jos koehenkilön seerumissa on paljon mitattua ainetta (eli se on liuoksessa vapaassa tilassa), osa vasta-aineista sitoutuu tähän aineeseen ja osa immobilisoituun aineeseen; vapaassa tilassa olevat (seerumista antigeeniin sitoutuneet) vasta-aineet poistetaan pesemällä ja havaittu signaali antaa kuoppaan immobilisoituun antigeeniin sitoutuneita vasta-aineita - se on alhainen, koska osa vasta-aineista poistettiin pesemällä.

Analyysin rakenne.

Antigeeni -proteiini immobilisoidaan kantajan pinnalle , johon lisätään liuos, joka sisältää määritettävän antigeenin ja kiinteän pitoisuuden leimaamattomia spesifisiä vasta-aineita, ja inkuboidaan.

Sitoutumattomien komponenttien poistamisen jälkeen lisätään kiinteä konjugaattikonsentraatio (tässä tapauksessa leimattuja sekundaarisia anti-lajien vasta-aineita).

Kantaja-aineen inkuboinnin ja pesun jälkeen havaitaan kiinteään faasiin muodostuneiden spesifisten immuunikompleksien entsymaattinen aktiivisuus.

Lyhyt kaavio: Antigeeni → (Antigeeni) + Vasta-aine → Vasta-aine-K

Havaitun signaalin arvo, samoin kuin suoraa kilpailevaa menetelmää käytettäessä, on kääntäen verrannollinen havaitun antigeenin pitoisuuteen .

Universaalin reagenssin - leimattujen anti-lajien vasta-aineiden - käyttö mahdollistaa vasta-aineiden havaitsemisen eri antigeeneille. Lisäksi analysoitu näyte ja leimattu reagenssi viedään järjestelmään eri vaiheissa, mikä eliminoi näytteen sisältämien erilaisten efektorien vaikutuksen entsyymileiman katalyyttisiin ominaisuuksiin. Tällainen analyysijärjestelmä kuitenkin vaikeuttaa sen toteuttamista lisävaiheiden käyttöönoton vuoksi. Tätä menetelmää käytetään esimerkiksi opiaattien (morfiini, heroiini), kannabinoidien (marihuana, hasis), amfetamiinien ja metamfetamiinien, barbituraattien laadulliseen ja kvantitatiiviseen havaitsemiseen. [neljä]

Homogeeninen ELISA

Vuonna 1972 Rubenshetein ja työtoverit kehittivät uuden lähestymistavan koko analyysin suorittamiseksi ilman kiinteää vaihetta. Menetelmää kutsuttiin homogeeniseksi ELISA:ksi (eng. "EMIT" - entsyymikerroin-immunomääritystekniikka) ja se perustui eroihin vapaassa muodossa olevan entsyymileiman katalyyttisissä ominaisuuksissa ja immunokemiallisessa kompleksissa. Sen ydin on pienen molekyylipainon omaavan antigeenin sitoutumisessa lysotsyymientsyymiin lähellä aktiivista keskustaa. Kompleksissa vasta-aineiden kanssa entsyymin aktiivinen keskus tulee steerisesti saavuttamattomiksi makromolekyylisubstraatille, joka on bakteerisolujen seinämät. Kun määritetyn antigeenin konsentraatio kasvaa, konjugaatin inaktiivisen kompleksin konsentraatio vasta-aineiden kanssa laskee, ja tämän seurauksena entsymaattisen reaktion rekisteröity parametri kasvaa. Tämän lähestymistavan perusteella kehitettiin sarjat useiden myrkyllisten, huumausaineiden ja lääkeaineiden määrittämiseen. EMIT-analyysin olennainen etu on mahdollisuus käyttää pieniä määriä analysoitua näytettä (5–50 μl) ja korkea havaitsemisnopeus (2–5 min), koska vapaan ja leimatun analyytin välillä ei ole erotusvaihetta. Menetelmän haittoja ovat alhaisempi herkkyys kuin heterogeenisessa ELISAssa (~ 1 μg/ml) ja mahdollisuus määrittää vain pienimolekyylipainoisia antigeenejä. [yksi]

ELISA:n ominaisuudet ja ongelmat

Kuten kaikki immunokemialliset analyysimenetelmät, ELISA voi antaa vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia. Esimerkiksi vääriä positiivisia tuloksia eri infektioiden vasta-aineiden määrittämisessä voi esiintyä nivelreumatekijän vuoksi , joka on immunoglobuliini M ihmisen omia immunoglobuliineja G vastaan; erilaisten systeemisten sairauksien, aineenvaihduntahäiriöiden tai lääkkeiden käytön yhteydessä muodostuneiden vasta-aineiden vuoksi; vastasyntyneillä tällaisia ​​vääriä positiivisia reaktioita voi esiintyä, koska lapsen kehossa muodostuu M-vasta-aineita äidin immunoglobuliini G:lle. Lisäksi polyklonaalinen aktivaatiooireyhtymä voi olla syynä vääriin positiivisiin tuloksiin. Samaan aikaan erityiset aineet - superantigeenit - stimuloivat epäspesifisesti B-lymfosyyttien eri infektioiden vasta-aineiden tuotantoa. Käytännössä tämä ilmaistaan ​​monien patogeenien vasta-ainetiitterin epäspesifisenä nousuna kerralla. [5] Väärin negatiiviset tulokset vasta-aineiden määrityksessä voivat johtua immuunikatotiloista sekä teknisistä virheistä reaktion formuloinnissa.

Siten entsyymi-immunomäärityksen kiistattomien etujen vuoksi: helppokäyttöisyys, nopeus, tulosten automatisoinnin ansiosta objektiivisuus, mahdollisuus tutkia eri luokkien immunoglobuliineja (mikä on tärkeää sairauksien varhaisessa diagnosoinnissa ja niiden ennusteessa). Tällä hetkellä yksi tärkeimmistä laboratoriodiagnostiikan menetelmistä.

Testijärjestelmien päätyypit käytetyistä antigeeneistä riippuen

Sen mukaan, mitä antigeenejä käytetään, ELISA-testijärjestelmät jaetaan:

  1. Lysaatti - joka käyttää natiivien antigeenien seosta (viljelmässä saatu lysoitu tai sonikoitu tartunta-aine);
  2. Rekombinantit - joissa käytetään geneettisesti muokattuja proteiineja - patogeenin tiettyjen proteiiniantigeenien analogit;
  3. Peptidi - käyttämällä kemiallisesti syntetisoituja proteiinifragmentteja.

ELISA-diagnostiikan yleinen kehityssuunta on suunta lysaattitestijärjestelmistä, joita yleisesti kutsutaan ensimmäisen sukupolven testijärjestelmiksi, yhdistelmä- ja peptiditesteihin.

Teknologia rekombinanttiproteiinien saamiseksi mahdollistaa lähes minkä tahansa yksittäisen antigeenin analogin saamisen melko puhtaassa muodossa.

Laadukkaan rekombinanttitestijärjestelmän luomiseksi on välttämätöntä valita patogeenin koko antigeenilajikkeesta antigeenit, jotka olisivat immunogeenisiä (eli vasta-aineita näille antigeeneille tulisi tuottaa tartunnan saaneen henkilön kehossa) ja erittäin spesifisiä. (eli tyypillistä vain tälle patogeenille ja mahdollisuuksien mukaan, jotka eivät anna ristireaktioita muiden antigeenien vasta-aineiden kanssa).

Lisäksi rekombinanttiproteiinien puhdistuksen laadulla on suuri merkitys. Ihannetapauksessa on mahdollista saada rekombinanttitestijärjestelmä, jolla on lähes 100 % spesifisyys ja korkea herkkyys.

Käytännössä tätä ei aina ole mahdollista saavuttaa, mutta parhaiden rekombinanttitestijärjestelmien spesifisyys lähestyy 100 %. Tällä hetkellä peptidientsyymi-immunoanalyysin perusteella voidaan sanoa, että kvantiferonitesti tuberkuloosin nopeaan ja tarkkaan diagnosointiin on onnistuneesti toteutettu.

Menetelmän näkökulmat ja kehitys

Yksi tärkeimmistä tehtävistä on löytää lähestymistapoja, jotka voivat merkittävästi lyhentää analyysiaikaa säilyttäen samalla korkean herkkyyden. Yksi näistä lähestymistavoista on analyysin siirtäminen kineettiseen järjestelmään, joka toteutetaan luomalla automaattisia laitteita, jotka perustuvat reaktioon virtausjärjestelmissä.

Monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö , jotka ovat spesifisiä vain tietylle analysoitavan yhdisteen antigeeniselle alueelle, avaa laajoja mahdollisuuksia . Valitsemalla sopivat vasta-aineet on mahdollista luoda varsin monimutkaisia ​​immunokemiallisia järjestelmiä, jotka mahdollistavat erilaisten yhdisteiden tunnistamisen.

ELISA-menetelmää kehitetään jatkuvasti. Toisaalta tutkimuskohteiden määrä kasvaa, toisaalta itse analyysimenetelmät syvenevät ja paranevat. Tämä johtaa siihen, että analyysikaavio yksinkertaistuu, sen toteuttamisaika lyhenee ja reagenssien kulutus vähenee. Jatkuvasti etsitään uusia ja uusia markkereina käytettäviä entsyymejä. Makromolekulaaristen yhdisteiden kemialla, solu- ja geenitekniikalla, jonka vaikutuksesta ELISA-reagenssien hankintatekniikat muuttuvat, on yhä suurempi vaikutus ELISAan. [1] Joten jos ennen geenitekniikan menetelmien käyttöönottoa oli välttämätöntä eristää vasta-aineet biologisista väliaineista (ja hyvä puhdistus vaatii huomattavia kustannuksia ja aikaa sekä reagenssien ja laitteiden käyttöikää), niin tällä hetkellä on mahdollista käyttää hyönteissoluja ( sirkka, cicada, torakka ) tai E. coli tuottamaan haluttua rekombinanttiproteiinia, joka, vaikka säilyttää halutut biologiset ominaisuudet, on myös suhteellisen puhdasta, joten se on paljon helpompi eristää seoksesta ja säilyttää stabiloivassa liuoksessa.

Muistiinpanot

  1. ↑ 1 2 3 4 AM Egorov, A.P. Osipov, B.B. Dzantiev, E.M. Gavrilov. [http://www.booksshare.net/index.php?id1=4&category=biol&author=egorov-am&book=1991 Entsyymi-immunomäärityksen teoria ja käytäntö ]. - M . : Kustantaja "Higher School", 1991. - S.  3 -42. — ISBN 5-06-000644-1 .
  2. ↑ 1 2 www.polismed.com . Haettu 12. huhtikuuta 2017. Arkistoitu alkuperäisestä 13. huhtikuuta 2017.
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Immunokemiallinen analyysi laboratoriolääketieteessä / V. V. Dolgov. - M.-Tver: LLC "Kustantamo" Triada "", 2015. - S. 34-38. — ISBN 978-5-94789-695-4 .
  4. ↑ www.monographies.ru
  5. ↑ Polyklonaalinen aktivaatio-oireyhtymä väärien positiivisten ELISA-tulosten syynä  (pääsemätön linkki)
 Henkilökohtainen lääketiede
Omix Data Sections
Sovellusosat
menetelmät
Aiheeseen liittyvät artikkelit