Southern blot

Kokeneet kirjoittajat eivät ole vielä tarkistaneet sivun nykyistä versiota, ja se voi poiketa merkittävästi 22. helmikuuta 2022 tarkistetusta versiosta . vahvistus vaatii 1 muokkauksen .

Southern blot [1] , Southern blot [2] , Southern blot [2] , Southern blot [3] , Southern blot [3] , Southern blot [4] , Southern blot [3] ( englanniksi.  Southern blot ) on molekyylibiologiassa käytetty menetelmä tietyn DNA-sekvenssin tunnistamiseksi näytteestä. Se koostuu agaroosigeelissä elektroforeesilla erotettujen DNA-fragmenttien siirtämisestä kalvosuodattimelle ja sitten niistä havaitsemisesta tunnettu sekvenssi DNA-koettimesta käyttämällähybridisaatio sen kanssa. Menetelmä on nimetty keksijän, englantilaisen biologin Edwin Southernin mukaan [5] .

Muut blot-siirtotekniikat, kuten Western blot , Northern blot ja Southwestern blot , käyttävät samanlaisia ​​menetelmiä, mutta RNA :n tai proteiinin havaitsemiseen näytteestä, ja ne on nimetty Southernin kehittämän menetelmän mukaan.

Menetelmä

  1. Restriktioendonukleaasit ( restriktioentsyymit ) suuren molekyylipainon DNA :n leikkaamiseksi pienemmiksi fragmenteiksi.
  2. DNA-fragmentit altistetaan agaroosigeelielektroforeesille pituuden erottamiseksi.
  3. Jos DNA-fragmentteja on yli 15 kb . , geeli käsitellään esimerkiksi suolahapolla ennen siirtoa . Tämä aiheuttaa DNA-fragmenttien depurinoitumisen ja hajottaa ne pienemmiksi paloiksi, mikä helpottaa myöhempää siirtymistä kalvolle.
  4. Tapauksessa, jossa käytetään alkalista siirtomenetelmää, agaroosigeeli asetetaan alkaliseen liuokseen, joka denaturoi DNA:n kaksoiskierteen ja helpottaa negatiivisesti varautuneen DNA:n sitoutumista positiivisesti varautuneeseen kalvoon myöhempää hybridisaatiota varten. Samaan aikaan myös RNA - tähteet tuhoutuvat .
  5. Agaroosigeelin ylä- tai alapuolelle asetetaan nitroselluloosa- ( tai nailon )kalvo. Paine kohdistetaan suoraan geeliin tai useiden paperikerrosten läpi. Onnistunut siirto edellyttää tiivistä kosketusta geelin ja kalvon välillä. Puskuri siirtyy kapillaarivoimien vaikutuksesta alueelta, jolla on korkea kosteuspotentiaali , alueelle, jolla on pieni kosteuspotentiaali (kalvo). Tässä tapauksessa DNA siirtyy geelistä kalvolle. Polyanioninen DNA sitoutuu positiivisesti varautuneeseen kalvoon ioninvaihtovuorovaikutusten voimien avulla.
  6. DNA:n lopullista kiinnittämistä varten kalvolle jälkimmäinen kuumennetaan tavanomaisessa tai tyhjiöuunissa 80 °C:n lämpötilaan kahdeksi tunniksi tai valaistaan ​​ultraviolettisäteilyllä (nylonkalvojen tapauksessa).
  7. Suorita radioaktiivisesti tai fluoresoivasti leimatun DNA-koettimen, jolla on ennalta määrätty DNA-sekvenssi, hybridisaatio kalvon kanssa.
  8. Hybridisaation jälkeen ylimääräinen DNA-koetin pestään pois kalvolta ja hybridisaatiokuvio visualisoidaan röntgenfilmillä autoradiografialla ( radioaktiivisen koettimen tapauksessa) tai kalvon värjäytymistä arvioidaan (kromogeenisen värjäyksen tapauksessa) .

Tulokset

Koettimen hybridisaatio spesifisen DNA-fragmentin kanssa suodatinkalvolla osoittaa, että tämä fragmentti sisältää DNA-sekvenssin , joka on komplementaarinen koettimen nukleotidisekvenssille.

Sovellus

Southern-blottausta, joka suoritetaan restriktioendonukleaaseilla käsitellylle genomiselle DNA:lle , voidaan käyttää genomin geenien kopiomäärän määrittämiseen. Koetin, joka hybridisoituu vain yhteen DNA-fragmenttiin, jota ei ole leikattu restriktioentsyymeillä, tuottaa yhden vyöhykkeen Southern-blotissa, kun taas useat nauhat blotissa osoittavat, että koetin on hybridisoitunut useisiin identtisiin sekvensseihin. Muutokset hybridisaatio-olosuhteissa (lämpötilan nostaminen, jossa hybridisaatio suoritetaan, suolapitoisuuden muuttaminen) johtavat spesifisyyden kasvuun ja hybridisaation vähenemiseen samankaltaisten mutta ei identtisten sekvenssien kanssa.

Muistiinpanot

  1. ↑ Hare R. G. , Butvilovsky V. E. , Davydov V. V. , Rachkovskaya I. V .. 7.2.2 DNA-fragmenttien analyysi  // Lääketieteellinen biologia ja yleinen genetiikka: oppikirja. — 2. painos, korjattu. - Minsk: Higher School, 2012. - S. 100. - 496 s. - ISBN 978-985-06-2182-5 .
  2. ↑ 1 2 Arefiev V. A. , Lisovenko L. A. . Southern blotting, Southern-transfer  // Englanti-venäläinen geneettisten termien selittävä sanakirja / tieteellinen. toim. L.I. Patrušev. - M. , 1995. - ISBN 5-85382-132-6 .
  3. ↑ 1 2 3 blot of Suzern  // Big Encyclopedic Dictionary of Medical Terms / toim. prof. E. G. Ulumbekova . - M.  : GEOTAR-Media, 2012. - S. 220. - 2263 s. - 2000 kappaletta.  — ISBN 978-5-9704-2010-2 .
  4. ↑ Blot: western, northern ja southern blot (blot, western, northern, southern) // Epidemiological Dictionary / toim. JM Last International Epidemiological Association; resp. toim. Venäjän toim. V. V. Vlasov . - 4. painos - M.  : OIZ, 2009. - S. 28, 272. - 316 s.
  5. ↑ Southern, E. M. Spesifisten sekvenssien havaitseminen geelielektroforeesilla erotettujen DNA-fragmenttien joukossa // J Mol Biol.. - 1975. - doi : 10.1016 /S0022-2836(75)80083-0

Katso myös