Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (tai kvantitatiivinen PCR, qPCR, PCR-RT, eng.  Real-time PCR, qPCR ) on polymeraasiketjureaktiomenetelmään perustuva laboratoriomenetelmä , jonka avulla voit määrittää paitsi kohdenukleotidin läsnäolon . näytteessä, mutta myös mittaa kopioiden lukumäärä . Monistetun DNA :n määrä mitataan jokaisen monistussyklin jälkeen käyttämällä fluoresoivia leimoja: koettimia tai interkalaattoreita . Arviointi voi olla kvantitatiivinen (templaatin kopioiden lukumäärän mittaus) ja suhteellinen (mittaus suhteessa lisättyyn DNA:han tai muihin kalibrointigeeneihin ) [ 1] .

Modifioitua kvantitatiivista PCR-menetelmää kutsutaan semi-quantitative PCR :ksi (semi-quantitative PCR). Sitä käytetään usein vertaamaan useiden geenien ilmentymistä . Tässä tapauksessa kertyneen tuotteen määrä mitataan vain yhdessä pisteessä - reaktion päätyttyä. [2]

Reaaliaikainen PCR yhdistetään usein muihin menetelmiin: RT-PCR ( RT-qPCR ) , ChIP - qPCR jne. [3]

Menetelmän kuvaus

QPCR-menettely on samanlainen kuin klassinen PCR -menettely , eli kaikki reaktion vaiheet ovat läsnä - kaksijuosteisen DNA :n sulaminen 95 °C:n lämpötilassa, alukkeiden pariutuminen (pariutumislämpötila riippuu käytetyistä alukkeista) ja pidentyminen lämpötila 72˚C, jos käytetään Taq-polymeraasia . PCR-tuotteen määrä mitataan kussakin PCR-syklissä käyttämällä fluoresoivia leimoja. Siten signaalin voimakkuus osoittaa kiinnostavan molekyylin alkuperäisen määrän [4] .

Vahvistuskaavio _

QPCR:ssä yleisesti käytetty nimikkeistö on:

  1. Perustaso ovat PCR-syklejä, joissa fluoresoiva signaali on alle sen arvon, jonka instrumentti pystyy havaitsemaan.
  2. ΔRn on fluoresoivan signaalin lisäys kullakin ajanhetkellä.
  3. Kynnysviiva on mielivaltainen fluoresenssin taso, joka on valittu perusviivan perusteella. Kynnyksen yläpuolella havaittu signaali katsotaan todelliseksi signaaliksi, jonka avulla voidaan määrittää näytteen kynnysjakso (Ct). Kynnysarvoa voidaan säätää kullekin kokeelle niin, että se on eksponentiaalisella alueella kaikilla kaavioilla.
  4. Syklien kynnysluku (Ct) on niiden PCR-syklien lukumäärä, joissa fluoresenssi ylittää kynnysarvon.

Kaavio koostuu perusviivasta, eksponentiaalisesta vaiheesta ja tasangosta [5] .

Alkuvaiheessa fluoresenssi on heikkoa, koska tuotetta on vähän, joten sitä on vaikea erottaa taustasta. Kun tuote kerääntyy, signaali kasvaa ensin eksponentiaalisesti ja saavuttaa sitten tasannen. Tasanne johtuu yhden tai toisen reaktion komponentin puutteesta - alukkeet , nukleotiditrifosfaatit , fluoresoiva leima voi loppua. Jos reaktiotuotetta on kertynyt liikaa, polymeraasista voi tulla rajoittava tekijä , jolloin tuotteen määrän riippuvuus syklistä tulee lineaariseksi . On syytä huomata, että tavallisessa reaaliaikaisessa PCR-reaktiossa kaikki näytteet tasoittuvat ja saavuttavat suunnilleen saman signaalitason. Näin ollen loppupiste ei kerro mitään testinäytteen alkuperäisestä määrästä. Toisaalta eksponentiaalisessa vaiheessa voidaan jäljittää eroja tuotteen määrän kasvuvauhdissa. Erot molekyylien alkuperäisessä lukumäärässä vaikuttavat syklien määrään, joka tarvitaan nostamaan fluoresenssitaso yli kohinatason [5] .

Ct on luku, jonka avulla voidaan arvioida kohde-DNA:n määrä liuoksessa, mutta Ct-arvo voi riippua monista satunnaisista tekijöistä, kuten ilmaisimen herkkyydestä , suodattimen laadusta jne. Siksi kiinnostavan tuotteen tarkka alkuperäinen määrä ei voida mitata. On olemassa normalisointimenetelmiä tämän ongelman ratkaisemiseksi . Mittaa kahden molekyylin määrän suhde näytteessä. Ne normalisoidaan yleensä kotihoitogeenien tuotteiksi - geeneiksi  , joiden lukumäärä solussa on aina suunnilleen sama (esimerkiksi infA-geeni, joka koodaa bakteerien translaation aloitustekijää ) . Suhde määritetään seuraavalla kaavalla:

jossa ja  ovat kahden näytteen alkusuureet, Ct B ja Ct A  ovat vastaavia Ct-arvoja ja  on PCR-tehokkuus, joka usein rinnastetaan tai [5] .

Sulamiskäyräanalyysi

Reaaliaikainen PCR mahdollistaa spesifisten monistettujen DNA-fragmenttien tunnistamisen käyttämällä niiden sulamislämpötilan (denaturaatio) analyysiä, jota kutsutaan myös Tm-arvoksi. Menetelmässä käytetään interkaloituvia väriaineita, yleensä SYBR Greeniä . DNA:n sulamispiste on spesifinen monistetulle fragmentille. Tämän menetelmän tulokset saatiin vertaamalla analysoitujen DNA-näytteiden dissosiaatiokäyriä . Kaksi sulamiskäyrää piirretään analysointia varten. Ensimmäinen on fluoresenssin riippuvuus ajasta, toinen on fluoresenssin laskun nopeus ajassa. Huippu heijastaa tiettyä DNA-mallia [5] .

Käytettyjen fluoroforien luokitus

Epäspesifinen määritelmä: kvantitatiivinen PCR ja kaksijuosteiset DNA : ta sitovat värit reporttereina

Tässä tapauksessa leima on kemiallinen yhdiste , joka pystyy liittymään DNA: n kaksoiskierteeseen . Tällainen koetin muuttaa konformaatiotaan vuorovaikutuksessa PCR-tuotteiden kanssa ja siitä tulee fluorofori . Tuotteen määritys voidaan suorittaa kunkin syklin lopussa ennen denaturointivaihetta . Esimerkki tällaisesta maalista on laajalti käytetty SYBR Green. Kaksijuosteiset DNA-värit (dsDNA) sitoutuvat kuitenkin kaikkeen dsDNA:han, mukaan lukien epäspesifiset PCR-tuotteet (kuten alukedimeeri ) . Tämä voi mahdollisesti häiritä kohdesekvenssin tarkkailun tarkkuutta [6] .

määritelmä: fluoresoiva reportterikoetin edit

Fluoresoivat koettimet havaitsevat vain DNA:ta sisältävän sekvenssin , joka on komplementaarinen koettimelle; siksi reportterikoettimen käyttö lisää suuresti spesifisyyttä ja mahdollistaa tarkemman mittauksen muun dsDNA :n läsnä ollessa . Fluoresoivat reportterikoettimet eivät kuitenkaan estä alukedimeerien inhiboivaa vaikutusta, mikä voi estää kohdereaktiotuotteiden kertymistä [7] .

On myös mahdollista käyttää useita koettimia, joiden fluoroforeilla on erilaiset emissiospektrit . Tässä tapauksessa on mahdollista rekisteröidä signaali eri DNA-molekyyleistä yhteen putkeen. Menetelmää kutsutaan moninkertaiseksi PCR : ksi (eng. multiplex PCR ) [8] .

Menetelmä perustuu monistustuotteelle komplementaarisen DNA-koettimen lisäämiseen, jossa on fluoresoiva reportteri koettimen toisessa päässä ja fluoresenssin sammuttaja toisessa päässä. Kun sammuttaja on lähellä reportteria, se absorboi signaalin eikä reportteri fluoresoi . Monistuksen aikana koettimen eheys rikkoutuu ja reportteri voidaan havaita fluoresenssilla laservirityksen jälkeen. Siksi sen tuotteen määrän lisääminen, johon reportterikoetin sitoutuu kussakin PCR-syklissä, aiheuttaa fluoresenssin suhteellista kasvua . Leimat voivat fluoresoida elongaatiovaiheessa tai PCR-pariutumisvaiheessa [4] .

Fluorofori ja sen sammutin on ommeltu anturiin 5'- ja 3'-päistä . Jos koetinsekvenssi ei ole kovin pitkä, niin jopa DNA:han sitoutuneessa tilassa ne ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa eikä fluoresenssia synny. Pidentämisen aikana DNA-polymeraasi , jolla on 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuutta (usein käytetty Taq-polymeraasi ), erottaa koettimen kohde-DNA :sta nukleotidi kerrallaan. Tämän prosessin seurauksena sekä fluorofori että sen sammuttaja pääsevät liuokseen, jossa todennäköisyys löytää näitä aineita lähistöltä on pieni ja fluoresenssi palautuu [4] .

  1. Fluorogeeninen hiusneula  on pieni yksijuosteinen DNA-molekyyli, joka kykenee vapaassa tilassaan muodostamaan DNA:n erityisen spatiaalisen rakenteen - hiusneulan . Ketjun toiseen päähän on ommeltu fluorofori ja toiseen sen sammuttava aine. Koetinsekvenssi on komplementaarinen kohde-DNA:lle. Tällöin liuoksessa kelluvat koetinmolekyylit eivät anna fluoresoivaa signaalia ja DNA -molekyyleihin sitoutuneet käyvät läpi konformaatiomuutoksia , jotka johtavat fluoroforin ja sen sammuttajan avaruudelliseen erottumiseen ja fluoresenssin palautumiseen. Rekisteröinti on suositeltavaa suorittaa denaturoinnin jälkeen [4] .
  2. FRET - menetelmään perustuva etiketti . Tämän menetelmän perustana on kahden koettimen läsnäolo, jotka sitoutuvat kohde-DNA:han lyhyen matkan päässä toisistaan. Fluoroforin luovuttaja ja fluoroforin vastaanottaja ommellaan yhden koettimen 5'-päähän ja vastaavasti toisen koettimen 3'-päähän . Kun ne ovat lähellä toisiaan, luovuttava fluorofori absorboi tietyn aallonpituuden valoa ja säteilee hehkua pidemmällä aallonpituusspektrillä . Tämä aalto puolestaan ​​absorboituu akseptorifluoroforiin ja lähettää rekisteröityä valoa. [4] .

Sovellus

Reaaliaikaista PCR:ää käytetään laajasti monissa tutkimussovelluksissa laboratorioissa. Lisäksi tätä menetelmää on käytetty lääketieteessä (sairauksien diagnosointiin) ja biotekniikan alalla ( mikro- organismien pitoisuuden määrittämiseen elintarvikkeista ja kasvimateriaaleista; GMO: ien havaitsemiseen ). qPCR:ää käytetään myös virusten ja muiden ihmisen patogeenien genotyypitykseen ja kvantifiointiin .

Tieteellinen tutkimus

Geeniekspression kvantifiointi

qPCR:ää käytetään yhtenä menetelmistä geenitranskription kvantitatiivisissa mittauksissa . Tätä menetelmää käytetään laajalti arvioimaan muutoksia tietyn geenin ilmentymisessä ajan myötä , esimerkiksi vasteena lääkkeen antamiseen tai ympäristöolosuhteiden muutoksiin. Geeniekspression kvantifiointi perinteisillä DNA-detektiomenetelmillä on epäluotettavaa. mRNA : n havaitseminen Northern blotilla , geeli-PCR-tuotteilla tai Southern blotilla ei mahdollista tarkkaa kvantitointia. Esimerkiksi 20-40 syklin sisällä tyypillisestä PCR:stä DNA-tuotteen määrä saavuttaa tasannen, joka ei suoraan liity kohde- DNA :n määrään alkuperäisessä PCR:ssä [9] .

Reaaliaikaista PCR:ää voidaan käyttää nukleiinihappojen kvantifiointiin kahdella yleisellä menetelmällä: suhteellisella kvantifikaatiolla ja absoluuttisella kvantitaatiolla [10] . Absoluuttinen kvantifiointi antaa tarkan määrän kohde-DNA - molekyylejä käyttämällä standardikäyrää . Siksi on tärkeää, että näytteen ja standardin PCR:llä on sama monistustehokkuus . Suhteellinen pisteytys perustuu sisäisiin vertailugeeneihin ( kotipitogeeneihin ) kohdegeenin ilmentymisen kerta-erojen määrittämiseksi. Kvantifiointi ilmaistaan ​​muutoksena mRNA:n ilmentymistasoissa, jotka tulkitaan komplementaariseksi DNA:ksi ( cDNA , tuotettu mRNA :n käänteistranskriptiolla ). Suhteellinen kvantifiointi on helpompi suorittaa, koska se ei vaadi kalibrointikäyrää, koska tutkittavan geenin määrää verrataan kontrolligeenin määrään [11] .

qPCR pienen tuma-RNA:n (snRNA) määrän määrittämiseksi

Pienet tuma-RNA :t (snRNA:t) eroavat ominaisuuksiltaan mRNA:ista hyvin lyhyellä pituudella (noin 22 nukleotidia ), niillä ei ole konservatiivista sekvenssiä päissä, kun taas yhden populaation snRNA:t voivat erota yhdellä tai useammalla nukleotidilla . Näiden ongelmien ratkaisemiseksi käytetään lähestymistapoja, jotka perustuvat pienen DNA -palan (linkkerin) lisäämiseen cDNA : han käänteistranskriptioreaktiossa . Sitten reaaliaikainen PCR suoritetaan standardimenetelmin käyttäen alukkeita, (biologia)|komplementaarisia linkkerille [12] .

Genomitutkimukset ChIP-qPCR:llä

Kromatiini-immunosaostusta (ChIP) yhdessä RT-qPCR : n kanssa pidetään genomitutkimuksen perusmenetelmänä , sen kaupallinen saatavuus ja korkea tarkkuus mahdollistavat nopean ja helpon proteiini-DNA-vuorovaikutusten analysoinnin. ChIP-qPCR:ää käytetään spesifisten geenien ja mahdollisten säätelyalueiden, kuten promoottorien , tutkimiseen . Tätä menetelmää käytetään tällä hetkellä useissa tutkimuksissa, mukaan lukien solujen erilaistuminen , suppressorigeenin hiljentäminen ja histonimuutosten vaikutus geenin ilmentymiseen [13] .

ChIP-analyysi kaappaa vain murto-osan mahdollisista koko genomissa esiintyvistä kohteista johtuen ristisilloitustehokkuuden vaihtelusta ja vasta -aineiden saatavuuden steerisesta rajoituksesta [13] .

ChIP-qPCR:n suorittamiseksi on tarpeen lisätä master-seos ( entsyymien ja nukleotidien seos ), alukkeet ja templaatti-DNA. Tässä tapauksessa on tarpeen valita tarkasti alukkeiden konsentraatio kohde-DNA:n tehokkaan monistamisen varmistamiseksi. Joko ChIP-DNA toimii templaattina tai negatiivisen kontrollin tapauksessa tyhjät helmet ilman DNA:ta. Sitten on tarpeen valita lämpökäsittelyjaksojen aika ja lämpötila ja aloittaa PCR. Tulokset analysoidaan samalla tavalla kuin qPCR-tulokset vertaamalla syöttötemplaatin ja ChIP-DNA-templaatin syklien kynnysmäärää (Ct) [3] .

Lääketieteellinen diagnostiikka

Kvantitatiivista PCR:ää käytetään tunnistamaan nopeasti geenit tai DNA-fragmentit, jotka ovat infektiotautien , geneettisten poikkeavuuksien jne. merkkiaineita. Tämän menetelmän käyttöönotto kliinisissä laboratorioissa on parantanut merkittävästi tartuntatautien diagnosoinnin laatua [14] . Lisäksi qPCR:ää käytetään työkaluna uusien sairauksien havaitsemiseen. Esimerkiksi uudet influenssakannat [ 15] .

QPCR:n käyttö mahdollistaa myös virusten , kuten hepatiitti B -viruksen , kvantitatiiviset mittaukset ja genotyypityksen (kantojen karakterisoinnin) [16] . Infektioaste , joka mitataan virusgenomin kopioiden lukumääränä potilaan kudosyksikköä kohti , on erittäin tärkeä. Esimerkiksi herpes simplex -viruksen tyypin 1 uudelleenaktivoitumisen todennäköisyys riippuu infektoituneiden hermosolmujen lukumäärästä [17] .

Potilailta, joilla epäillään koronavirusinfektiota , otetaan vanupuikko kurkusta, RNA uutetaan ja analysoidaan RT-qPCR :llä . Kohdegeenit ovat avoin lukukehys 1ab (ORF1ab) ja nukleokapsidiproteiini (N). Syklin kynnys (Ct-arvo) alle 37 määritellään positiiviseksi testitulokseksi ja Ct-arvo 40 tai enemmän negatiiviseksi testitulokseksi. Nämä diagnostiset kriteerit perustuvat Kansallisen virustautien torjunta- ja ehkäisyinstituutin suosituksiin [18] .

RT-qPCR- testin herkkyys on 83,3 %, tämä testi on altis väärille negatiivisille tuloksille . Tietokonetomografiaa käytetään myös koronaviruksen diagnosointiin , jonka herkkyys on paljon korkeampi ja on 97,2 % [19] .

Kvantitatiivista PCR:ää käytetään laajalti myös kasvainsolujen havaitsemiseen kiinteissä kasvaimissa [20] [21] ja jopa joissakin leukemian muodoissa [22] [23] .

qPCR auttaa havaitsemaan kiertäviä kasvainsoluja . Esimerkiksi rintasyöpä on edelleen syöpäpotilaiden yleisin kuolinsyy. Lisäksi kuoleman aiheuttavat usein syntyneet etäpesäkkeet . Metastaasseja esiintyy sen seurauksena, että lisääntymiseen kykenevät solut erotetaan kasvaimesta , joutuvat verenkiertoon ja asettuvat uudelleen johonkin kehon osaan. Näitä soluja kutsutaan kiertäviksi kantasoluiksi (CSC). Tällaisten solujen esiintyminen rintasyöpäpotilaiden veressä liittyy yleensä huonoon ennusteeseen hoidon tuloksesta ja eloonjäämisestä yleensä, joten se on erittäin tärkeä diagnostinen parametri. Mutta erittäin alhaisen määrän vuoksi CVT :n tunnistaminen  on vaikea tehtävä.

Ja qPCR:ää erittäin herkänä menetelmänä voidaan käyttää tämän ongelman ratkaisemiseen. CST : t ovat epiteelialkuperää ja ilmentävät siksi tiettyä geenisarjaa , joka eroaa niitä ympäröivistä verisoluista , jotka ovat mesenkymaalista alkuperää. Tämän menetelmän soveltamiseksi on tarpeen määrittää CST-markkerigeenien joukko ja arvioida niiden ilmentymistaso [24] .

Mikrobiologiassa

Reaaliaikaista PCR:ää käytetään myös mikrobiologiseen työhön elintarviketurvallisuuden alalla, veden (juoma- ja jäteveden) laadun arvioinnissa sekä kansanterveyden alalla [25] . Lisäksi tätä menetelmää käytetään suoliston mikroflooran tunnistamiseen [26] .

Kasvien patogeenien havaitseminen

Maatalousteollisuus tuottaa taudinaiheuttajista vapaita siemeniä ja taimia taloudellisten menetysten estämiseksi ja tuotteiden säilyvyyden pidentämiseksi. Siksi on kehitetty järjestelmiä havaitsemaan pieniä määriä phytophthora ( Phytophthora ramorum ), munamykeettiä ja joitain muita taudinaiheuttajia , jotka tappavat tammia ja muita isäntäkasvin DNA:han sekoitettuja kasvilajeja. Kyky erottaa taudinaiheuttajan ja isäntäkasvin DNA:n välillä perustuu kullekin taksonille ominaisten ITS-sekvenssien ( internal transcribed spacer) monistumiseen, ribosomaalisen RNA -geenin koodaavalla alueella sijaitsevien sisäisten transkriptoitujen alueiden monistumiseen [27] . ] .

Geneettisesti muunnettujen organismien tunnistaminen

qPCR:llä (käyttämällä käänteistä transkriptiota ) voidaan havaita geneettisesti muunnettuja organismeja , koska se on herkempi kuin monet muut menetelmät. Tässä tapauksessa spesifisiä alukkeita käytetään monistamaan vektorin luontiprosessissa käytettyä promoottoria, terminaattoria tai välimuotosekvenssiä . Koska siirtogeenisen kasvin luomisprosessi johtaa yleensä useamman kuin yhden siirtogeenin kopion liittämiseen , sen määrä arvioidaan yleensä myös qPCR:llä. Tässä tapauksessa kasvia, joka sisältää tämän geenin yhtenä kopiona, käytetään kontrollina [28] [29] .

Muistiinpanot

  1. ↑ VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM 25 vuotta kvantitatiivista PCR: ää geeniekspressioanalyysiin  //  Biotechniques : päiväkirja. - 2008. - Voi. 44 . - s. 619-626 . - doi : 10.2144/000112776 . — PMID 18474036 .
  2. ↑ Selma Gouvêa-Barros, Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira. Puolikvantitatiivinen PCR hepatotoksisten syanobakteerien kvantifiointiin  // Journal of Environmental Protection. - 2012. - T. 03 , no. 05 . — S. 426–430 . — ISSN 2152-2219 2152-2197, 2152-2219 . - doi : 10.4236/jep.2012.35053 .
  3. ↑ 1 2 Tae Hoon Kim, Job Dekker. ChIP – Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (ChIP-qPCR)  (englanniksi)  // Cold Spring Harbor Protocols. - 2018-05. — Voi. 2018 , iss. 5 . - P.pdb.prot082628 . - ISSN 1559-6095 1940-3402, 1559-6095 . - doi : 10.1101/pdb.prot082628 .
  4. ↑ 1 2 3 4 5 Provenzano M. , Mocellin S. Täydentävät tekniikat: geeniekspressiotietojen validointi kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä.  (Englanti)  // Kokeellisen lääketieteen ja biologian edistysaskel. - 2007. - Voi. 593 . - s. 66-73 . - doi : 10.1007/978-0-387-39978-2_7 . — PMID 17265717 .
  5. ↑ 1 2 3 4 Kubista M. , Andrade JM , Bengtsson M. , Forootan A. , Jonák J. , Lind K. , Sindelka R. , Sjöback R. , Sjögreen B. , Strömbom L. , Ståhlberg A. , Zoric N. Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio  . (Englanti)  // Lääketieteen molekyylinäkökohdat. - 2006. - Huhtikuu ( osa 27 , nro 2-3 ). - s. 95-125 . - doi : 10.1016/j.mam.2005.12.007 . — PMID 16460794 .
  6. ↑ Xiujuan Peng, Alex Nguyen, Debadyuti Ghosh. M13- ja T7-bakteriofagien kvantifiointi TaqManilla ja SYBR-vihreällä qPCR:llä  (englanniksi)  // Journal of Virological Methods. - 2018-02. — Voi. 252 . — s. 100–107 . — ISSN 0166-0934 . - doi : 10.1016/j.jviromet.2017.11.012 .
  7. ↑ E. Navarro, G. Serrano-Heras, M. J. Castaño, J. Solera. Reaaliaikainen PCR-tunnistuskemia  (englanniksi)  // Clinica Chimica Acta. - 2015-01. — Voi. 439 . — s. 231–250 . - doi : 10.1016/j.cca.2014.10.017 . Arkistoitu 1. toukokuuta 2020.
  8. ↑ Steve F. C. Hawkins, Paul C. Vieras. Multipleksianalyysit reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR :llä  //  Multiplex Biomarker Techniques. — New York, NY: Springer New York, 29.11.2016. — s. 125–133 . - ISBN 978-1-4939-6729-2 , 978-1-4939-6730-8 .
  9. ↑ L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon. Reaaliaikaisen käänteistranskriptaasi-PCR:n käyttö sytokiinigeenin ilmentymisen kvantifiointiin  // Biomolecular Techniques: JBT. - 2003-03. - T. 14 , no. 1 . — s. 33–43 . — ISSN 1524-0215 . Arkistoitu alkuperäisestä 29. huhtikuuta 2016.
  10. ↑ S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group. Erilaisten standardien vertailu reaaliaikaiseen PCR-pohjaiseen absoluuttiseen kvantifiointiin  // Journal of Immunological Methods. – 31.3.2010. - T. 354 , no. 1-2 . — s. 34–39 . — ISSN 1872-7905 . - doi : 10.1016/j.jim.2010.01.004 . Arkistoitu alkuperäisestä 2.3.2019.
  11. ↑ Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). Reaaliaikainen PCR-käsikirja / Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). — Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). - 2014. - S. 40-43. – 68 s.
  12. ↑ Benes V. , Castoldi M. MikroRNA:n ilmentymisprofilointi reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR:llä, miten sitä käytetään ja mitä on saatavilla.  (englanti)  // Methods (San Diego, Kalifornia). - 2010. - huhtikuu ( osa 50 , nro 4 ) - s. 244-249 . - doi : 10.1016/j.ymeth.2010.01.026 . — PMID 20109550 .
  13. ↑ 12 Patrik Asp. ChIP:n yhdistäminen qPCR:n kanssa  //  Kromatiini-immunosaostus / Neus Visa, Antonio Jordán-Pla. - New York, NY: Springer New York, 2018. - Vol. 1689 . — s. 29–42 . - ISBN 978-1-4939-7379-8 , 978-1-4939-7380-4 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7380-4_3 .
  14. ↑ Sails AD (2009). Kliinisen mikrobiologian sovellukset. Reaaliaikainen PCR: Nykyinen tekniikka ja sovellukset . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  15. ↑ FDA sallii influenssalääkkeiden hätäkäytön, diagnostisen testin vasteena sikainfluenssaepidemian puhkeamiseen ihmisillä. FDA News, 27. huhtikuuta 2009.
  16. ↑ Yeh SH , Tsai CY , Kao JH , Liu CJ , Kuo TJ , Lin MW , Huang WL , Lu SF , Jih J. , Chen DS , Chen PJ Hepatiitti B -viruksen kvantifiointi ja genotyypitys yhdessä reaktiossa reaaliaikaisella PCR:llä ja sulamiskäyräanalyysi.  (Englanti)  // Journal of Hepatology. - 2004. - lokakuu ( osa 41 , nro 4 ). - s. 659-666 . - doi : 10.1016/j.jhep.2004.06.031 . — PMID 15464248 .
  17. ↑ Sawtell NM Herpes simplex -viruksen tyypin 1 in vivo uudelleenaktivoitumisen todennäköisyys kasvaa latenttien infektoituneiden hermosolujen määrän kasvaessa ganglioissa.  (Englanti)  // Journal Of Virology. - 1998. - elokuu ( osa 72 , nro 8 ). - P. 6888-6892 . — PMID 9658140 .
  18. ↑ Dawei Wang, Bo Hu, Chang Hu, Fangfang Zhu, Xing Liu. Kliiniset ominaisuudet 138 sairaalahoidossa olevasta potilaasta, joilla oli vuonna 2019 uusi koronaviruksen aiheuttama keuhkokuume Wuhanissa, Kiinassa   // JAMA . – 17.3.2020. — Voi. 323 , iss. 11 . - s. 1061 . — ISSN 0098-7484 . doi : 10.1001 / jama.2020.1585 . Arkistoitu 1. huhtikuuta 2020.
  19. ↑ Chunqin Long, Huaxiang Xu, Qinglin Shen, Xianghai Zhang, Bing Fan. Koronavirustaudin (COVID-19) diagnoosi: rRT-PCR vai CT?  (englanti)  // European Journal of Radiology. – 2020-05. — Voi. 126 . — P. 108961 . doi : 10.1016 / j.ejrad.2020.108961 . Arkistoitu 14. toukokuuta 2020.
  20. ↑ Cen P. , Ni X. , Yang J. , Graham DY , Li M. Kiertyvät kasvainsolut haimasyövän diagnosoinnissa ja hoidossa.  (englanniksi)  // Biochimica Et Biophysica Acta. - 2012. - joulukuu ( osa 1826 , nro 2 ) - s. 350-356 . - doi : 10.1016/j.bbcan.2012.05.007 . — PMID 22683404 .
  21. ↑ Young R. , Pailler E. , Billiot F. , Drusch F. , Barthelemy A. , Oulhen M. , Besse B. , Soria JC , Farace F. , Vielh P. Circulating kasvainsolut keuhkosyöpässä.  (englanniksi)  // Acta Cytologica. - 2012. - Vol. 56 , nro. 6 . - s. 655-660 . - doi : 10.1159/000345182 . — PMID 23207444 .
  22. ↑ Brüggemann M. , Gökbuget N. , Kneba M. Akuutti lymfoblastinen leukemia: minimaalisen jäännössairauden seuranta terapeuttisena periaatteena.  (englanniksi)  // Onkologian seminaarit. - 2012. - Helmikuu ( osa 39 , nro 1 ). - s. 47-57 . - doi : 10.1053/j.seminoncol.2011.11.009 . — PMID 22289491 .
  23. ↑ DiNardo CD , Luger SM Morfologian lisäksi: minimaalinen jäännössairauden havaitseminen akuutissa myelooisessa leukemiassa.  (englanti)  // Current Opinion In Hematology. - 2012. - maaliskuu ( osa 19 , nro 2 ). - s. 82-88 . - doi : 10.1097/MOH.0b013e3283501325 . — PMID 22314322 .
  24. ↑ Andergassen U. , Kölbl AC , Hutter S. , Friese K. , Jeschke U. Verenkierron kasvainsolujen havaitseminen rintasyöpäpotilaiden verestä RT-qPCR:n avulla.  (englanniksi)  // Syövät. - 2013. - 25. syyskuuta ( osa 5 , nro 4 ). - s. 1212-1220 . - doi : 10,3390/syöpä5041212 . — PMID 24202442 .
  25. ↑ Filion, M (toimittaja) (2012). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR sovelletussa mikrobiologiassa Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0 .
  26. ↑ Nobre Giselle , S. Miglioranz Lucia Helena. Probiootit: vaikutukset ihmisten terveyteen ja tämän hetken näkymiin   // Probiootit . - 2012 - 3. lokakuuta. — ISBN 9789535107767 . - doi : 10.5772/50048 .
  27. ↑ Baldwin BG Tuman ribosomaalisen DNA:n sisäisten transkriptoitujen välikkeiden fylogeneettinen hyöty kasveissa: esimerkki yhdistelmästä.  (englanniksi)  // Molecular Phylogenetics and Evolution. - 1992. - Maaliskuu ( osa 1 , nro 1 ) . - s. 3-16 . — PMID 1342921 .
  28. ↑ Holst-Jensen A. , Rønning SB , Løvseth A. , Berdal KG PCR-tekniikka geneettisesti muunnettujen organismien (GMO) seulomiseen ja kvantifiointiin.  (englanti)  // Analyyttinen ja bioanalyyttinen kemia. - 2003. - huhtikuu ( nide 375 , nro 8 ). - s. 985-993 . - doi : 10.1007/s00216-003-1767-7 . — PMID 12733008 .
  29. ↑ Brodmann PD , Ilg EC , Berthoud H. , Herrmann A. Reaaliaikaiset kvantitatiiviset polymeraasiketjureaktiomenetelmät neljälle geneettisesti muunnetulle maissilajikkeelle ja maissin DNA-pitoisuudelle elintarvikkeissa.  (englanti)  // AOAC Internationalin lehti. - 2002. - toukokuu ( osa 85 , nro 3 ) . - s. 646-653 . — PMID 12083257 .

Kirjallisuus

  • Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Periaatteet ja soveltaminen. - Moskova: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .