Keinotekoinen genomi on biologisen tutkimuksen suunta, joka liittyy olemassa olevien organismien geneettiseen muuntamiseen uusien ominaisuuksien omaavien organismien luomiseksi. Toisin kuin geenitekniikka , keinotekoinen genomi koostuu kemiallisesti syntetisoiduista geeneistä.
Oletetaan, että tulevaisuudessa keinotekoisia genomeja voidaan luoda ilman DNA:ta tai käyttämällä erilaisia nukleotidijoukkoja ja muita koodausperiaatteita kuin luonnollisissa genomeissa. Siten keinotekoisten genomien luominen on yksi synteettisen biologian alueista .
On ymmärrettävä, että kun puhumme geenien synteesistä luonnollisilla geneettisillä koodeilla tai niiden pienillä modifikaatioilla . On mahdollista syntetisoida keinotekoinen geeni , joka koodaa mitä tahansa ennalta määrättyä polypeptidiä , mutta on silti mahdotonta suunnitella pohjimmiltaan uutta polypeptidiä niin, että se ainakin taittuu proteiinipalloksi , puhumattakaan siitä, että syntynyt proteiini alkaa toimia entsyyminä .
Tällä hetkellä korkein saavutus keinotekoisen genomin luomisen alalla on Craig Venterin vuonna 2010 toteuttama Mycoplasma mycoides -bakteerin kromosomin synteesi.
Vuonna 2010 Craig Venter Instituten henkilökuntaonnistui syntetisoimaan keinotekoisesti Mycoplasma mycoides -bakteerin syklisen kromosomin , jonka koko on 1 077 947 nukleotidiparia [1] . Kromosomi istutettiin Mycoplasma capricolum -bakteerin soluun , jonka jakautumisen jälkeen muodostui solu, jota täysin kontrolloi keinotekoinen genomi.
Tämä keinotekoinen genomi tunnetaan nyt koodinimellä JCVI-syn1.0. Se toistaa lähes täysin yhden Mycoplasma mycoides -bakteerikannan genomin , lukuun ottamatta useita keinotekoisesti lisättyjä geneettisiä markkereita ( englanninkielinen vesileima, vesileima ), useita synteesin aikana poistettuja merkityksettömiä geenejä ja 19 mutaatiota, jotka syntyivät bakteerin kokoamisen aikana . DNA -fragmentit . Keinotekoisen genomin omaavat solut toimivat normaalisti ja pystyvät jakautumaan useaan otteeseen.
Keinotekoisen genomin työ alkoi Frederick Sangerin ja hänen työtovereidensa työllä, jotka vuonna 1977 onnistuivat muodostamaan bakteriofagin φX174 genomin täydellisen nukleotidisekvenssin, jonka pituus oli 5375 nukleotidiparia [2] . Kahdeksantoista vuotta myöhemmin, vuonna 1995, Craig Venterin ryhmä sekvensoi ensimmäistä kertaa itsestään replikoituvan organismin, 1 830 137 parin Haemophilus influenzae -bakteerin genomin [3] .
Viimeisten 25 vuoden aikana (1985-2010) genomin sekvensointinopeus on kasvanut vähintään 8 suuruusluokkaa. Niiden organismien määrän räjähdysmäinen kasvu, joiden genomit on luettu, on synnyttänyt ongelman kunkin geenin biologisen roolin ymmärtämisessä organismissa. Viime aikoihin asti ei ollut selvää, sisältääkö genomi täydellistä tietoa organismin rakenteesta ja olisiko organismi, jolla on kemiallisesti syntetisoitu genomi, elinkelpoinen. Toinen molekyylibiologian edessä oleva kysymys oli, ovatko bakteerien genomit vähimmäistarpeet ja mikä on pienin joukko geenejä, jotka voivat luoda elävän solun.
Vuonna 1996 Arkady Mushegyan ja Evgeny Kunin ( National Center for Biotechnology Information , USA ) ehdottivat, että gramnegatiivisen bakteerin Haemophilus influenzae ja grampositiivisen bakteerin Mycoplasma genitalium yhteiset 256 ortologista geeniä ovat hyvä likimääräinen vähimmäismäärä. solugeenit [4] . Vuonna 2004 Valencian yliopiston ( Espanja ) tutkijaryhmä ehdotti 206 proteiinia koodaavan geenin sarjaa, jotka saatiin useiden bakteerigenomien analysoinnista [5] .
Craig Venterin ryhmän tutkijat ovat luoneet organismia, jolla on minimaalinen keinotekoisesti syntetisoitu genomi vuodesta 1995 [1] . Vuonna 1995 he sekvensoivat Mycoplasma genitaliumin genomin, joka on ihmisen virtsaelinten sairauksien aiheuttaja. Se on pienin tähän mennessä tunnettu organismi, joka pystyy lisääntymään. Tämä mikro-organismi sisältää 517 geeniä, joista 482 koodaa proteiineja . Genomin kokonaistilavuus on 580 tuhatta nukleotidiparia. Vuoteen 1999 mennessä analysoimalla transposonien sijaintia sekvensoiduissa genomeissa oli mahdollista todeta, että 265-350 geeniä ovat elintärkeitä organismille ja yli 100 geenillä on tuntematon tarkoitus [6] . Lisätutkimukset vuoteen 2005 mennessä laajensivat elintärkeiden geenien luettelon 382:een [7] .
Myöhemmin löydettiin vielä pienempiä prokaryoottigenomeja, mutta ne kaikki kuuluvat pakollisiin symbiontteihin - organismeihin, jotka eivät kykene itsenäiseen olemassaoloon.
Vuonna 2003 490 885 parin Nanoarchaeum equitans -genomi sekvensoitiin [8] . On myös todettu, että Buchnera -lajin sekvensoimattoman genomin pituus on noin 450 tuhatta paria [9] .
Pienin tähän mennessä dekoodatuista bakteerigenomeista on Carsonella - bakteerin solunsisäisen endosymbiontin genomi, joka koostuu 159 662 nukleotidiparista ja sisältää vain 182 proteiinia koodaavaa geeniä. Japanilaiset tutkijat sekvensoivat tämän genomin vuonna 2006 [10] .
Craig Venterin ryhmä kehitti teknologian suurten DNA -molekyylien syntetisoimiseksi, joka perustuu kemiallisesti syntetisoituihin 5-7 tuhannen parin fragmentteihin, joita kutsutaan kasetteiksi . Fragmentit koottiin osittain in vitro sopivilla entsyymeillä , osittain in vivo -rekombinaatiolla Saccharomyces cerevisiae -hiivasolussa . Täydellinen synteettinen genomi on onnistuneesti kloonattu sentromeeriplasmidiksi ( YCp ) hiivasoluihin [11] .
Ensimmäinen yritys luoda keinotekoinen genomi, joka tehtiin vuonna 2008, koostui 582 970 parin pituisen Mycoplasma genitalium -kromosomin synteesistä. Kemiallisesti syntetisoiduista polynukleotideista kootut päällekkäiset, 5–7 tuhannen parin kokoiset kasetit yhdistettiin entsyymien avulla peräkkäin 24, 72 ja 144 tuhannen parin fragmenteiksi (1/24, 1/8 ja 1/). 4 genomista). Genomin täydellinen kokoonpano neljästä komponentista suoritettiin rekombinaatiolla Saccharomyces cerevisiae -solussa . Tuloksena olevan kromosomin sekvensointi vahvisti synteesin tarkkuuden. Prototyyppinä käytettiin bakteeri M. genitalium alalajia G37 (näyte MG408), jonka patogeeninen aktiivisuus estettiin erityisellä markkerilla. Keinotekoisen genomin tunnistamiseksi DNA:han lisättiin "vesileimoiksi" kutsuttuja nukleotidisekvenssejä [ 11 ] .
Tiettyjä vaikeuksia ilmeni synteettisen kromosomin siirrossa luovuttajasolusta (hiiva) vastaanottajasoluun. Erillinen ongelma oli alkuperäisen genomin poistaminen bakteerisolusta sen korvaamiseksi synteettisellä.
Jatkokokeissa M. genitalium -bakteerit jouduttiin luopumaan geneettisestä prototyypistä niiden erittäin alhaisen kasvunopeuden vuoksi. Vuonna 2010 tehdyissä tutkimuksissa prototyyppinä käytettiin Mycoplasma mycoides subsp. caprin ( GM12 ) genomia ja vastaanottajana Mycoplasma capricolum subsp . capricolum (CK) .
Teknologian kehittämiseksi kromosomien siirtämiseksi hiivasolusta vastaanottajasoluun on kehitetty menetelmiä kokonaisten kromosomien kloonaamiseksi hiivan sentromeeristen plasmidien muodossa. M. mycoides -bakteerin luonnollista kromosomia käytettiin kokeiden kohteena . Ensimmäiset yritykset siirtää M. mycoides -kromosomi M. capricolum -soluun päättyivät kuitenkin epäonnistumiseen. Kuten kävi ilmi, ongelma oli bakteerisolujen restriktiojärjestelmässä . M. mycoidesin ja M. capricolumin restriktiojärjestelmät ovat samat, niiden DNA on metyloitunut, eikä kromosomin suorassa siirtymisessä solusta toiseen ole ongelmia [12] . Hiivaan kloonattu DNA ei ole metyloitunut, ja kun se siirretään M. capricolum -bakteeriin , restriktiojärjestelmä tuhoaa. Tämän välttämiseksi luovuttajan DNA metyloitiin puhdistetulla metylaasilla tai M. mycoides- tai M. capricolum -uutteella tai vastaanottajasolun restriktiojärjestelmä yksinkertaisesti tuhottiin [13] .
Toinen yritys syntetisoida bakteerigenomi tehtiin vuonna 2010. Prototyypiksi valittiin Mycoplasma mycoides -bakteerin (alalaji capri GM12) kromosomi, jonka tilavuus on 1,08 miljoonaa nukleotidiparia . Tämän keinotekoisen genomin koodinimi oli JCVI-syn1.0. Työhön käytettiin kahta genomia: CP001621 [14] ( GenBank-tietokanta ), jonka sekvensoi J. Glassin ryhmä Craig Venter Institutesta vuonna 2007 [12] , ja siirtogeenistä genomia CP001668 [15] , jonka sekvensoi ryhmä Carol Lartik vuonna 2009 [13] . Näytteen CP001621 perusteella kasetteja syntetisoitiin ja käytettiin jatkosynteesiin. Näytteen CP001668 sekvensoinnin lopussa suoritettiin täsmäytys, joka havaitsi eroja 95 fragmentissa. Biologisesti merkittäviksi havaitut erot korjattiin jo syntetisoitujen kasettejen osalta. 19 eroa, jotka eivät vaikuta bakteerin elintoimintoon, jätettiin ennalleen. Neljälle genomin alueelle, jotka eivät ole elintärkeitä, muodostuu 4 WM1-WM4-merkkiä, joiden pituus on vastaavasti 1246, 1081, 1109 ja 1222 paria. Tuloksena saatu M. mycoides JCVI syn1.0 -geenisekvenssi syötettiin GenBank-tietokantaan koodilla CP002027 [16] .