Streptavidin / ˌstrɛpˈtævɪdɪn / on 66,0 kDa ( tetrameeri ) proteiini , puhdistettu Streptomyces avidinii - bakteerista . _ _ _ _ _ _ Streptavidiinihomotetrameereillä on erittäin korkea affiniteetti biotiiniin (tunnetaan myös B7-vitamiinina tai H-vitamiinina). Kun dissosiaatiovakio (K d ) on suuruusluokkaa ≈10 -14 mol/l [1] , biotiinin sitoutuminen streptavidiiniin on yksi vahvimmista luonnossa tunnetuista ei-kovalenttisista vuorovaikutuksista. Streptavidiinia käytetään laajalti molekyylibiologiassa ja bionanoteknologiassa, koska streptavidiini-biotiinikompleksi kestää orgaanisia liuottimia, denaturoivia aineita (esim. guanidiinikloridi ), pesuaineita (esim. SDS , Triton X-100 ), proteolyyttisiä entsyymejä sekä äärimmäisiä lämpötila- ja pH-arvoja.
Kaksi ryhmää kuvaili biotiiniin sitoutuneen streptavidiinin kiderakenteen vuonna 1989. Hendrickson et ai. [2] Columbian yliopistossa ja käyttämällä useita isomorfisia substituutioita Weber et al. [3] EI DuPont Central Research and Developmentissa. Syyskuuhun 2017 mennessä 171 rakennetta on talletettu Protein Data Bankiin . Katso tästä linkistä täydellinen luettelo . Täyspitkän 159 tähteen proteiinin N- ja C-päät käsitellään muodostamaan lyhyempi "ydin" streptavidiini, joka koostuu tyypillisesti tähteistä 13-139; N- ja C-pään poistaminen on välttämätöntä korkeimman biotiinin sitoutumisaffiniteetin saavuttamiseksi. Streptavidiinimonomeerin toissijainen rakenne koostuu kahdeksasta antirinnakkaisesta β-juosteesta, jotka laskostuvat muodostaen antirinnakkaisen β-tynnyrin tertiaarisen rakenteen. Biotiinin sitoutumiskohta sijaitsee kunkin β-tynnyrin toisessa päässä. Neljä identtistä streptavidiinimonomeeriä (eli neljä identtistä p-vartta) sitoutuvat muodostamaan streptavidiinin tetrameerisen kvaternaarisen rakenteen. Biotiinin sitoutumiskohta kussakin varressa koostuu jäännöksistä varren sisältä sekä konservoitunutta Trp120:ta viereisestä alayksiköstä. Siten jokainen alayksikkö osallistuu viereisen alayksikön sitoutumiskohtaan, ja siksi tetrameeriä voidaan pitää myös funktionaalisten dimeerien dimeerinä.
Lukuisat streptavidiini-biotiinikompleksin kiderakenteet ovat paljastaneet tämän merkittävän affiniteetin alkuperän. Ensinnäkin sidetaskun ja biotiinin välillä on suuri muodon täydentävyys. Toiseksi sitoutumiskohdassa on laaja vetysidosverkosto, joka muodostuu biotiinin kanssa. Sitoutumiskohdassa on kahdeksan vetysidosta suoraan tähteisiin (ns. vetysidosten "ensimmäinen kuori"), mukaan lukien tähteet Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 ja Asp128. Siellä on myös vetysidosten "toinen kuori", mukaan lukien jäännökset, jotka ovat vuorovaikutuksessa ensimmäisen kuoren tähteiden kanssa. Streptavidiinin affiniteetti biotiiniin ylittää kuitenkin sen, mikä voitaisiin ennustaa pelkästään vetysidosvuorovaikutuksista, mikä viittaa toiseen mekanismiin, joka myötävaikuttaa korkeaan affiniteettiin [4] . Biotiinia sitova tasku on hydrofobinen , ja biotiinin ollessa taskussa on lukuisia van der Waalsin välittämiä kontakteja ja hydrofobisia vuorovaikutuksia, minkä uskotaan myös selittävän korkean affiniteetin. Erityisesti tasku on vuorattu säilötyillä tryptofaanijäännöksillä. Lopuksi biotiinin sitoutumiseen liittyy β-säikeitä 3 ja 4 (L3/4) yhdistävän joustavan silmukan stabiloituminen, joka sulkeutuu sitoutuneen biotiinin päälle, toimii "kannen" sidostaskun päällä ja mahdollistaa äärimmäisen hitaan vapautumisen. biotiini. dissosiaationopeus.
Useimmat yritykset mutatoida streptavidiini johtavat biotiinin sitoutumisaffiniteetin vähenemiseen, mikä on odotettavissa tällaisessa optimoidussa järjestelmässä. Äskettäin luodun streptavidiinimutantin, traptavidiinin, havaittiin kuitenkin dissosioivan biotiinia yli kymmenen kertaa hitaammin korkeamman lämpö- ja mekaanisen stabiiliuden lisäksi [5] . Tätä dissosiaationopeuden laskua seurasi assosiaationopeuden kaksinkertainen lasku.
Biotiinin sitoutumisaffiniteetti voidaan häiritä streptavidiinin kemiallisella leimauksella, kuten aminoreaktiivisilla fluoroforeilla ; flavidiini on streptavidiinimutantti, jossa ei ole lysiinin sivuketjuja ja joka säilyttää hyvät biotiinin sitoutumisominaisuudet sen jälkeen, kun se on leimattu fluoresoivalla väriaineella, kun väriaine on kytketty aminopäähän [6] .
Streptavidiinin yleisimpiä käyttötarkoituksia ovat erilaisten biomolekyylien puhdistaminen tai havaitseminen. Streptavidiinin ja biotiinin voimakasta vuorovaikutusta voidaan käyttää erilaisten biomolekyylien kiinnittämiseen toisiinsa tai kiinteään kantajaan. Tiukat olosuhteet ovat välttämättömiä häiritsemään streptavidiini-biotiini-vuorovaikutusta, joka usein denaturoi puhdistettavaa kiinnostavaa proteiinia. On kuitenkin osoitettu, että lyhyt inkubointi vedessä yli 70 °C:ssa katkaisee vuorovaikutuksen palautuvasti (ainakin biotinyloidun DNA:n osalta) ilman streptavidiinin denaturoitumista, mikä mahdollistaa streptavidiinin kiinteän kantajan uudelleenkäytön [7] . Toinen streptavidiinin käyttökohde on Strep-tag- peptidillä geneettisesti muunnettujen proteiinien puhdistaminen ja havaitseminen . Streptavidiinia käytetään laajalti Western blot -analyysissä ja immunomäärityksissä konjugoituna joihinkin reportterimolekyyleihin, kuten piparjuuriperoksidaasiin . Streptavidiinia on käytetty myös nousevalla nanobioteknologian alalla käyttämällä biologisia molekyylejä, kuten proteiineja tai lipidejä, luomaan nanomittakaavan laitteita/rakenteita. Tässä yhteydessä streptavidiinia voidaan käyttää rakennuspalikkana biotinyloitujen DNA-molekyylien sitomiseen, jotta yksiseinäisistä hiilinanoputkista [8] tai jopa monimutkaisista DNA-polyhedraista [9] voidaan luoda tukirakenteita . Tetrameeristä streptavidiinia on käytetty myös keskuksena, jonka ympärille voidaan sijoittaa muita proteiineja joko affiniteettitunnisteella, kuten Strep-tagilla tai AviTagilla , tai geneettisellä fuusiolla SpyTagin kanssa [10] . Fuusio SpyTagin kanssa mahdollisti 8 tai 20 streptavidiinialayksikön kokoonpanojen luomisen. Atomivoimamikroskopiatutkimuksiin tarkoitetun molekyylivoimakoettimen [11] ohella on luotu myös uusia materiaaleja, kuten kolmiulotteisia kidehiloja [12] . Streptavidiinin heikosti hapan isoelektrinen piste (pI) on ~5, mutta kaupallisesti saatavilla on myös streptavidiinin rekombinanttimuotoa , jolla on lähes neutraali pI.
Esikohdennettu immunoterapiaEsikohdennettu immunoterapia käyttää streptavidiinia konjugoituna monoklonaaliseen vasta-aineeseen syöpäspesifisiä antigeenejä vastaan, minkä jälkeen injektoidaan radioaktiivisesti leimattua biotiinia säteilyn kuljettamiseksi vain syöpäsoluun. Ensimmäisiä esteitä ovat streptavidiinin biotiinin sitoutumiskohtien kyllästäminen endogeenisellä biotiinilla annetun radioleimatun biotiinin sijasta ja korkea radioaktiivinen altistuminen munuaisille johtuen streptavidiinin vahvoista adsorptioominaisuuksista soluihin. Tämän korkean sitoutumisen tason kiinnittyviin solutyyppeihin, kuten aktivoituihin verihiutaleisiin ja melanoomiin, uskotaan nyt johtuvan streptavidiinin RYD-sekvenssin välittämästä integriinin sitoutumisesta [13] .
Streptavidiini on tetrameeri ja jokainen alayksikkö sitoo biotiinia samalla affiniteetilla. Multivalenssi on etu sovelluksissa, kuten MHC-tetrameerivärjäys , jossa aviditeettivaikutukset parantavat streptavidiiniin kiinnittyneiden MHC-molekyylien kykyä havaita spesifisiä T-soluja [14] . Muissa tapauksissa, kuten streptavidiinin käyttö spesifisten proteiinien visualisoimiseksi soluissa, polyvalenssi voi heikentää kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin toimintaa. Yksiarvoinen streptavidiini on streptavidiinin muokattu rekombinanttimuoto, joka on tetrameeri, mutta vain yksi neljästä sitoutumiskohdasta on toimiva. Tämän yksittäisen sitoutumiskohdan affiniteetti on 10–14 mol/l, eikä se voi aiheuttaa silloittamista [15] . Yksiarvoisen streptavidiinin sovelluksia ovat olleet solupinnan reseptorien fluoresenssiseuranta, DNA-origami - koristelu ja osoittimena toimiminen kryoelektronimikroskoopin tiettyjen alueiden tunnistamisessa .
Monomeerinen streptavidiini on streptavidiinin rekombinanttimuoto, jossa on mutaatioita tetrameerin pilkkomiseksi monomeeriksi ja tuloksena olevan eristetyn alayksikön liukoisuuden lisäämiseksi. Streptavidiinin monomeeristen versioiden affiniteetti biotiiniin on 10 -7 mol/l 10 -8 mol/l, joten ne eivät ole ihanteellisia leimaamiseen, mutta ne ovat käyttökelpoisia puhdistuksessa, kun reversiibeliä halutaan [16] [17] .
KaksiarvoinenStreptavidiinia, jossa on täsmälleen kaksi biotiinin sitoutumiskohtaa tetrameeriä kohti, voidaan valmistaa sekoittamalla alayksiköitä funktionaalisen biotiinin sitoutumiskohdan kanssa ja ilman ja puhdistamalla ioninvaihtokromatografialla . Tässä toiminnallisilla sitoutumiskohdilla on sama biotiinin sitoutumisstabiilisuus kuin villityypin streptavidiinilla. Kaksiarvoinen streptavidiini, jossa on kaksi biotiinin sitoutumiskohtaa yhdessä (cis-bivalenttinen) tai erikseen (trans-bivalenttinen), voidaan puhdistaa erikseen [18] .
KolmiarvoinenStreptavidiinia, jossa on täsmälleen kolme biotiinin sitoutumiskohtaa tetrameeriä kohti, voidaan myös valmistaa käyttämällä samaa periaatetta kuin kaksiarvoisia streptavidiineja [19] .
Korkean valenssin streptavidiinitKorkeamman valenssin streptavidiineja on tuotettu käyttämällä isopeptidisidoskonjugaatiokemiaa käyttämällä SpyTag/SpyCatcher-tekniikkaa [20] . Tämä viittaa streptavidiinitetrameeriin, jossa on kolme biotiinin sitoutumiskohtaa ja kuollut streptavidiini fuusioituna joko SpyTagiin tai SpyCatcheriin. Kun eri tetrameerejä sekoitetaan keskenään, muodostuu kovalenttinen sidos, joka tarjoaa lisää biotiinin sitoutumiskohtia. Tällä menetelmällä luotiin kuusi ja kaksitoista biotiinin sitoutumiskohtaa molekyyliä kohden.
Streptavidiini ei ole ainoa proteiini, joka voi sitoa biotiinia suurella affiniteetilla. Avidiini on toinen tunnetuin biotiinia sitova proteiini. Alunperin munankeltuaisesta eristetyllä avidiinilla on vain 30 % sekvenssi-identtisyys streptavidiinin kanssa, mutta lähes identtinen sekundaarinen, tertiäärinen ja kvaternäärinen rakenne. Avidiinilla on korkeampi affiniteetti biotiiniin ( Kd ~ 10-15 M ), mutta toisin kuin streptavidiini, avidiini on glykosyloitunut, positiivisesti varautunut ja sillä on pseudokatalyyttistä aktiivisuutta (avidiini voi tehostaa biotiinin ja nitrofenyylin välisen esterisidoksen alkalista hydrolyysiä). ryhmä) ja sillä on suurempi taipumus aggregoitua. Toisaalta streptavidiini on paras biotiinikonjugaatin sideaine; avidiinilla on pienempi sitoutumisaffiniteetti kuin streptavidiinilla, kun biotiini on konjugoitu toiseen molekyyliin, huolimatta siitä tosiasiasta, että avidiinilla on suurempi affiniteetti vapaaseen, konjugoimattomaan biotiiniin. Koska streptavidiinilla ei ole hiilihydraattimodifikaatiota ja sillä on lähes neutraali pI , sen etuna on paljon pienempi epäspesifinen sitoutuminen kuin avidiinilla. Deglykosyloitu avidiini (NeutrAvidin) on verrattavissa kooltaan, pI:ltä ja epäspesifiseltä streptavidiiniin sitoutumiselta.
Ryhmät, jotka tutkivat ja kehittävät streptavidiinin tai avidiiniperheen proteiineja (aakkosjärjestyksessä)