Calponin ( eng. Calponin ) on aktiinia sitovien proteiinien perheen jäsen, tyypillinen pääasiassa G- ja F - aktiinia sitoville sileille lihassoluille . Kalponiinit ovat kolmen geenin tuotteita, ja ne jaetaan ns. α-kalponiiniin (h1 tai emäksinen, 292 a.k. , 34 kDa), β-kalponiiniin (252 a.k.) - joka on saman geenin tuote kuin α-kalponiini. , mutta jossa on aminohappojen deleetio segmentissä 216-256 . Kaksi muuta isoformia, neutraali kalponiini (h2 calponiini) ja hapan kalponiini, ilmentyvät sileissä lihaksissa ja ei-lihassoluissa. Muita kalponiinien edustajia ovat SM22 ja transgeliini. Calponin on saanut nimensä CH- tai Calponin Homology -domeenista, jota esiintyy monien ABP:iden (aktiinia sitovien proteiinien ) joukossa. Tästä tosiasiasta huolimatta kalponiini ei osoita aktiinin sitoutumista tämän kohdan kautta (Gimona ja Mital, 1998), vaan sen sijaan sitoo lipidejä (Bogatcheva ja Gusev, 1995; Fujii et ai., 1995). Aktiinia sitovan kohdan uskotaan (Mezgueldi et ai., 1992) olevan CH-domeenin ja kalponiinin kaltaisten toistojen välisellä alueella (CLIK - kalponiinin kaltainen toisto). Calponin on lämpöstabiili. Sileän lihaksen isoformin molekyylipaino on 34 kDa. Muissa kudoksissa on enemmän happamia kalponiinin isoformeja, jotka eivät sido kalsiumia , mutta sitovat kalmoduliinia . Ca2 + /kalmoduliinin sitoutuminen estää sitoutumista aktiiniin. Kalponiinin fosforylaatio seriini-treoniinikinaasien toimesta johtaa samanlaiseen vaikutukseen . Kalponiinilla on myös tropomyosiinia sitova kohta.
Kalponiini on aktiinia, kalmoduliinia ja tropomyosiinia sitova proteiini, jota on löydetty useiden selkärankaisten sileistä lihaskudoksista ja joistakin ei-lihassoluista. Ohuiden kanan mahalaukun filamenttien valmistuksen aikana osoitettiin, että ne sisältävät aktiinia, tropomyosiinia, kaldesmonia ja kalponiinia moolisuhteessa 7:0,9:0,6:0,7. Kuten kaldesmon, kalponiini estää aktomyosiini ATPaasin aktiivisuutta liuoksessa, liu'uttamalla aktiinia suhteessa fosforyloituun myosiiniin in vitro , ja tämän eston laukaisee Ca2 + /kalmoduliini. Esto poistetaan proteiinin fosforylaatiolla in vitro . Nämä ominaisuudet viittaavat siihen, että kalponiini voi olla aktiini-myosiini-vuorovaikutusten lisäsäätelijä.
Kalponiinin täydellinen tai osittainen kymotryptinen pilkkominen suoritetaan 25 °C:ssa käyttämällä proteaasin ja substraatin painosuhdetta 1:100 tai 1:1000, vastaavasti 10 mM imidatsoli - HCl , 30 mM NaCl , 2 mM MgCl2 , 4 mM. NaN3 , pH 7,0, F-aktiinin (4 mg/ml) puuttuessa tai läsnä ollessa (aktiini/kalponiini-moolisuhde = 3:1). Sopivin aikavälein (0-60 min) tarkoin määritellyt proteiinimäärät sekoitetaan yhtä suureen tilavuuteen Laemmlin kiehuvaa näytepuskuria ja valmistetaan geelielektroforeesia varten . Silloitusreaktioita ja sitoutumiskokeita varten digestio lopetetaan 2,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridilla (PMSF) . Kalponiini-aktiini kovalenttisen kompleksin (11 mg/ml) kokonaishydrolyysi CNBr:lla (67 mg/ml lisättynä kahtena yhtä suurena määränä) suoritetaan 24 tunnin ajan 70 % muurahaishappoa sisältävässä 14 mM p-merkaptoetanolissa.
Kalponiini (0,7-1,3 mg/ml) 10 mM imidatsoli-HCl:ssa, 30 mM NaCl:ssa, 2 mM MgCl2:ssa, 4 mM NaN3:ssa, pH 7,0, sekoitettuna natiiviin tai subtilisiinilla pilkottuun F-aktiiniin (2,4-4,5 mg/ml) ( kalponiini/aktiini-moolisuhde = 1:3) 2 mM EDC:n ja 5 mM NHS:n läsnä ollessa. Reaktio suoritettiin 25 °C:ssa 0-30 minuuttia ja sitä seurattiin SDS-geelielektroforeesilla. Caldesmon (1,4 mg/ml) silloittaa F-aktiinin kanssa samoissa olosuhteissa käyttämällä proteiinin moolisuhdetta 1:6. Kovalenttinen sidos F-aktiinin ja kalponiinin 22 kDa:n NH2-terminaalisen kymotryptisen fragmentin välillä saadaan seuraavasti: Kalponiinin 60 minuutin kymotryptinen pilkkominen entsyymin ja substraatin painosuhteessa 1:1000 täydennetään F-aktiinilla klo. moolisuhde 1:3, sen jälkeen, kun on sentrifugoitu 180 000 x g 1 tunnin ajan 4 °C:ssa, pelletti suspendoidaan uudelleen imidatsoli-HCl:iin, pH 7,0, puskuriin. 76 kDa:n F-aktiini-kalponiiniadduktin preparatiivista erottamista varten silloittamattomasta kalponiinista 45 minuutin reaktion jälkeen saatu silloitettu F-aktiini-kalponiiniliuos (110 mg proteiinia) säädettiin 3 mM β-merkaptoetanoliin, joka oli dialysoitu . yön yli 4 °C:ssa depolymerointipuskuria vastaan (50 mM Tris -HCl, 0,6 m KI, 5 mM natriumtiosulfaatti, 0,5 mM ATP , 0,5 mM CaCl2 ja 0,5 mM p-merkaptoetanoli, pH 7,5) ja suodatetaan sitten geelin läpi. Sephacryl -S-300- kolonni (1,6 x 120 cm), tasapainotettu 4 °C:ssa samassa puskurissa. Alkuperäiset proteiinifraktiot eluoidaan sisältäen 76 kDa:n additiotuotteen, josta puuttuu vapaa kalponiini geelielektroforeesilla analysoituna. Yhdistetyt fraktiot dialysoidaan tislatulla vedellä, lyofilisoidaan ja altistetaan CNBr- digestiolle .